La caracterización bioquímica de la polifenol oxidasa de Dimocarpus longan proporciona información sobre su eficiencia catalítica

Scientific Reports volumen 12, Número de artículo: 20322 (2022) Citar este artículo

945 Accesos

1 Citas

3 Altmetric

Detalles de métricas

Las frutas "ojo de dragón" producidas por el árbol tropical longan son ricas en nutrientes y antioxidantes. Sufren de pardeamiento enzimático poscosecha, un proceso del que es responsable principalmente la familia de enzimas polifenol oxidasas (PPO). En este estudio, se han clonado dos ADNc que codifican la PPO a partir de hojas de Dimocarpus longan (Dl), expresados ​​heterólogamente en Escherichia coli y purificados por cromatografía de afinidad. El prepro-DlPPO1 contiene dos péptidos señal en su extremo N-terminal que facilitan el transporte de la proteína al estroma del cloroplasto y al lumen del tilacoide. La eliminación de los dos péptidos señal de prepro-DlPPO1 produce pro-DlPPO1. El prepro-DlPPO1 exhibió una mayor tolerancia térmica que el pro-DlPPO1 (desplegándose a 65 °C frente a 40 °C), lo que sugiere que el péptido señal puede estabilizar el pliegue de DlPPO1. DlPPO1 se puede clasificar como una tirosinasa porque acepta sustratos tanto monofenólicos como difenólicos. El pro-DlPPO1 exhibió la mayor especificidad hacia la difenol (–)-epicatequina natural (kcat/KM de 800 ± 120 s−1 mM−1), que es mayor que para el 4-metilcatecol (590 ± 99 s−1 mM− 1), pirogalol (70 ± 9,7 s−1 mM−1) y ácido cafeico (4,3 ± 0,72 s−1 mM−1). Las eficiencias cinéticas de prepro-DlPPO1 son 23, 36, 1,7 y 4,7 veces menores, respectivamente, que las observadas con pro-DlPPO1 para los cuatro sustratos difenólicos mencionados anteriormente. Además, los estudios de acoplamiento mostraron que la (–)-epicatequina tiene una energía de unión más baja que cualquier otro sustrato investigado. Tanto los estudios cinéticos como in-silico sugieren fuertemente que la (-)-epicatequina es un buen sustrato de DlPPO1 y determinan la afinidad de las PPO hacia compuestos flavonoides específicos.

Las polifenol oxidasas (PPO) son metaloenzimas dicobre de tipo III presentes en bacterias1, hongos2,3, arqueas4, plantas5, insectos6,7 y animales, incluidos los humanos8,9. La familia PPO contiene tirosinasas (TYR)10,11,12,13 y catecol oxidasas (CO)14,15. Los TYR catalizan la ortohidroxilación de monofenoles a o-difenoles (actividad monofenolasa, EC 1.14.18.1) y posteriormente la oxidación de los o-difenoles correspondientes a o-quinonas (actividad difenolasa, EC 1.10.3.1), mientras que los CO solo pueden realizar esta última actividad difenolasa13,16. Las quinonas resultantes son compuestos altamente reactivos y se polimerizan rápidamente de forma no enzimática, formando así pigmentos complejos de color amarillo a negro conocidos como melaninas17,18.

In vivo, las PPO vegetales se traducen como una proteína precursora (prepro-PPO), correspondiente a la traducción de ~ 600 aminoácidos con aproximadamente 60–75 kDa19,20. Una prepro-PPO contiene tres dominios distintos; una secuencia de señal N-terminal, el dominio catalíticamente activo que alberga el sitio Cu-Cu y un dominio C-terminal que protege el dominio activo5,20,21 (Figura S1). La secuencia señal (~ 80–100 aminoácidos) dirige la proteína a su destino subcelular mientras se escinde22,23. Después de la translocación a través de la membrana tilacoide, la proteína pasajera restante se procesa a una forma latente (forma pro), que generalmente se informa que es de 45 a 69 kDa14. El centro de cobre binuclear, donde cada cobre está coordinado individualmente por tres residuos de histidina17,24 ubicados en el dominio activo, permanece protegido por el dominio C-terminal, lo que previene de manera efectiva la exposición del sitio activo a sustratos candidatos. La latencia se eleva cuando el dominio C-terminal se separa del sitio activo. In vitro, la alteración puede verse afectada por proteasas (p. ej., tripsina, proteinasa K)25, pH ácido o básico24, ácidos grasos26 y detergentes artificiales (p. ej., dodecilsulfato de sodio, SDS)17,27,28,29,30,31, 32,33. Aunque se desconoce el mecanismo proteolítico natural17, recientemente se informó que las PPO de plantas son capaces de autoactivarse, lo que puede separar autoproteolíticamente la enzima activa del dominio C-terminal34,35,36.

Longan (Dimocarpus longan, Dl) pertenece a la familia Sapindaceae y es nativa de la región subtropical del sudeste asiático37,38. El fruto está enriquecido con varios componentes nutricionales, especialmente el pericarpio contiene altas cantidades de compuestos fenólicos39,40,41 como (-)-epicatequina, 4-metilcatecol, pirogalol, ácido cafeico, ácido gálico, quercetina, ácido vanílico y ácido ferúlico ( Figura S2) que exhiben fuertes actividades antiinflamatorias, antioxidantes y anticancerígenas42,43. A pesar de los beneficios para la salud obtenidos de los compuestos fenólicos, el pericarpio de longan puede deteriorarse rápidamente y desarrollar un color marrón dos o tres días después de la cosecha a temperatura ambiente44. La presencia de los complejos marrones resultantes reduce sustancialmente la calidad de los frutos. Se han aplicado enfoques físicos que incluyen inmersión en fungicidas, cera, revestimiento de quitosano y fumigación con azufre para prolongar la vida útil de almacenamiento del longan45,46,47,48,49; sin embargo, la reacción de pardeamiento sigue siendo el principal problema de la industria del longan47. Aunque los PPO se han investigado extensamente como la causa principal del pardeamiento poscosecha en muchos productos agrícolas11,12,50,51,52,53,54,55,56,57,58,59,60,61, solo se dispone de pocos informes. disponible sobre las propiedades bioquímicas de longan PPO62,63,64. La enzima se extrajo de la fuente natural y se purificó por precipitación con sulfato de amonio y sucesivas cromatografías en columna (Sephadex G-200 y Phenyl Sepharose) o diálisis62,63. Se informó que el pH y la temperatura óptimos para el longan PPO extraído eran 6,5 y 35 °C, respectivamente62. La enzima era activa frente a pirogalol, 4-metilcatecol y catecol. Otro informe también describió la (-)-epicatequina como el sustrato endógeno óptimo para longan63. También se clonó un gen longan PPO64 pero no se ha expresado de forma heteróloga. La clasificación enzimática de los longan PPO sigue siendo desconocida y su especificidad y eficiencia cinética hacia los sustratos fenólicos no se han estudiado bien hasta el momento.

Aquí, se han clonado dos ADNc que contienen genes PPO a partir de hojas de Dimocarpus longan. El pro-DlPPO1 codifica una forma latente, mientras que el prepro-DlPPO1 codifica un precursor de la forma latente que además contiene una secuencia señal N-terminal en su secuencia proteica. Esta secuencia señal consta de un péptido de tránsito que facilita el transporte al estroma del cloroplasto y una señal de transferencia de tilacoides que designa la luz de los tilacoides como el destino final de la proteína65. Por lo general, las bacterias no reconocen los péptidos señal de las plantas. Aunque toda la secuencia se traduce en una proteína, el hecho de que las bacterias no puedan procesar adecuadamente los péptidos señal puede provocar que la proteína completa se agregue durante la expresión. En este trabajo, una prepro-PPO se expresó con éxito en un sistema procariótico por primera vez, se purificó hasta la homogeneidad y se analizó bioquímicamente en comparación con la proenzima análoga. Se han evaluado las propiedades cinéticas de ambas variantes frente a sustratos fenólicos. Los sustratos caracterizados cinéticamente se clasificaron en dos grupos: sustratos naturales ((–)-epicatequina, 4-metilcatecol, ácido cafeico y pirogalol) (Figura S2) y sustratos estándar (tiramina, tirosina, dopamina y L-DOPA) (Figura S3) . Los sustratos naturales se refieren a compuestos fenólicos que se detectaron previamente en extractos de longan por HPLC39,40,41 mientras que los sustratos estándar son los que se usan comúnmente para caracterizar PPO3,17,66,67,68 (que pueden o no estar presentes en frutos de longan). Además, se emplearon estudios de acoplamiento que aplicaron una estructura modelo de DlPPO1 para investigar las interacciones enzima-sustrato. El presente estudio tuvo como objetivo dilucidar el impacto bioquímico de la presencia de su secuencia señal en DlPPO1 y fue diseñado para proporcionar la información fundamental de la aceptación del sustrato y la especificidad de DlPPO1 que es necesaria para idear nuevos métodos sostenibles para mejorar el pardeamiento poscosecha de este fruta tropical de importancia comercial.

Los productos de PCR en el ADN complementario de D. longan con cebadores que enmarcan el ORF para prepro-DlPPO1 y pro-DlPPO1 produjeron bandas distintas de aproximadamente 1800 pb y 1500 pb, respectivamente (Figura S4). Después de la clonación en el vector pGEX-6P-SG69, la secuenciación de Sanger confirmó que la prepro-DlPPO1 está compuesta por un ORF de 1797 nucleótidos y codifica 599 aminoácidos que son 100 % idénticos a la secuencia de aminoácidos deducida de la DlPPO1 publicada ( Entrada Uniprot: A0A0K0NPU9)64. El pro-DlPPO1 contiene un ORF de 1512 nucleótidos que codifican 503 aminoácidos (Tabla S1) y tiene una identidad del 99,60 % con la secuencia DlPPO1 publicada anteriormente64 resultante de cinco aminoácidos alterados (Pro46Arg, Glu226Asp, Gln451His, Ile455Met y Asn486Tyr, Figura S5) . Las enzimas pro-DlPPO1 y prepro-DlPPO1 se expresaron heterólogamente en E. coli con una etiqueta de glutatión-S-transferasa N-terminal de Schistosoma japonicum69 (ver Materiales y Métodos). Se variaron las temperaturas en la inducción de isopropil-ß-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) durante la expresión (37 °C, 28 °C y 17,5 °C) para investigar una condición favorable para la producción de alto nivel de proteína soluble. La Figura S6 muestra que la temperatura de expresión más eficiente tanto para pro-DlPPO1 como para prepro-DlPPO1 fue de 17,5 °C, mientras que 37 °C dio como resultado el nivel de expresión más bajo de las formas solubles y no solubles. También se informaron producciones efectivas de enzimas PPO solubles bajo expresiones a baja temperatura para TYR de Juglans regia (20 °C)67, Agaricus bisporus (20 °C)3, Solanum lycopersicum (20 °C)17, Malus domestica (20 °C) 66, Streptomyces avermitilis (18 °C)70, Streptomyces sp. ZL-24 (19 °C)68 y Larrea tridentata (25 °C)32.

Se ha informado que el dominio C-terminal de las PPO eucarióticas es necesario para el plegamiento del dominio catalítico71. Hasta el momento, la expresión de PPO72 de uva activa es el único ejemplo de producción exitosa de una PPO vegetal sin su dominio C-terminal.

A través de la purificación por cromatografía de afinidad aplicando la afinidad del glutatión inmovilizado en agarosa reticulada, las expresiones produjeron 35,3 y 60,0 mg por litro de cultivo de expresión de pro-DlPPO1 fusionado con GST y prepro-DlPPO1 fusionado con GST, respectivamente (Figura S7) . La eliminación de la etiqueta de fusión GST por la proteasa HRV3C dio como resultado 5,7 y 7,0 mg de pro-DlPPO1 y prepro-DlPPO1 latentes, respectivamente (Tabla 1). La prepro-DlPPO1 se purificó con éxito con una recuperación del 13,5 % de la actividad proteica total y una actividad específica de 7,09 ± 0,05 U mg−1, mientras que la pro-DlPPO1 se recuperó con una recuperación del 19,6 % de la actividad proteica total y una actividad específica de 28,3 ± 0,04 U mg−1. Los contenidos de cobre de las variantes de DlPPO1 se midieron fotométricamente reduciendo Cu(II) a Cu(I) con ascorbato y siguiendo la complejación de Cu(I) con 2,2′-biquinolina a 546 nm73. Se observó que los contenidos de cobre de pro-DlPPO1 y prepro-DlPPO1 fueron 1,3 ± 0,018 y 2,0 ± 0,030 iones de cobre por sitio activo, respectivamente. Las proteínas recién purificadas eluyeron en Tris-HCl 50 mM y NaCl 250 mM a pH 7,5 y se cambiaron inmediatamente a MES 100 mM y NaCl 200 mM a pH 6,5, y se aplicó glicerol al 30% (v/v) para el almacenamiento de ambos. se forma a -80 °C hasta su uso. La pureza de las preparaciones finales de pro-DlPPO1 y prepro-DlPPO1 se confirmó mediante SDS-PAGE (Fig. 1 y Figura S8 para los geles completos).

SDS-PAGE de pro-DlPPO1 (izquierda) y prepro-DlPPO1 (derecha) en diferentes etapas de purificación. (A) fracción insoluble de los sedimentos de células bacterianas, (B) proteínas solubles totales, C) GST-DlPPO1, que es la proteína de fusión GST eluida después de la cromatografía de afinidad con glutatión (primer paso de purificación en ÄKTA FPLC), (D) fracciones de proteínas después de que GST-DlPPO1 fuera cortado por la proteasa HRV3C y E) el producto DlPPO1 final (marcado con un marco rojo; consulte la Tabla 2) de la segunda ronda de cromatografía de afinidad con glutatión. El primer carril de cada gel es el marcador de peso molecular. Los geles de longitud completa se muestran en la Figura S8.

La electroforesis en gel demostró una banda prominente de pro-DlPPO1 y prepro-DlPPO1 purificados finales a aproximadamente ~ 57 kDa y ~ 67 kDa, respectivamente, lo que sugirió que las formas latente (pro-DlPPO1) y precursora (prepro-DlPPO1) de longan PPO1 eran obtenido. Las masas teóricas de pro-DlPPO1 y prepro-DlPPO1 se calcularon a partir de la fórmula de suma de las respectivas proteínas utilizando el peso atómico y la composición isotópica de los elementos constituyentes74 considerando la presencia de dos enlaces disulfuro conservados (−4H o −4.032 Da) y un puente tioéter (−2H o −2,016 Da) como se muestra en la Tabla 2. Para confirmar los pesos moleculares reales de la ionización por electropulverización enzimática, se aplicó espectrometría de masas (ESI-MS). El pro-DlPPO1 produjo 56 845 Da (Fig. 2), lo que está en excelente acuerdo con la masa calculada de la proteína a partir del GlyProMet derivado del vector (marcado como − 3, − 2, − 1 en la Figura S5) hasta el final de la secuencia de las PPO's latentes (Ala 1 → Asp 503). Esto confirma que pro-DlPPO1 se expresó como una forma de PPO latente con dos enlaces disulfuro y un puente tioéter. Además, se determinó que prepro-DlPPO1 tenía una masa de 67.285 Da, que contenía también un puente tioéter y dos enlaces disulfuro (Fig. 2). La masa coincide perfectamente con la secuencia completa del prepro-polipéptido (Met 1 → Asp 599) más los tres aminoácidos GlyProMet (−3, −2, −1) que surgen del vector de expresión.

ESI-MS del precursor prepro-DlPPO1 y pro-DlPPO1 latente. Se muestran los espectros de masas completos de (A) pro-DlPPO1 y (B) prepro-DlPPO1, mientras que el recuadro representa la vista ampliada de las dos etapas de carga más prominentes. Las masas calculadas y medidas de los dos estados de la enzima se enumeran en la Tabla 2.

El ensayo de desplazamiento térmico se ha utilizado para evaluar la estabilidad térmica de las proteínas recombinantes8,17,75. Aquí, se probó la estabilidad térmica de las proteínas pro-DlPPO1 y prepro-DlPPO1 purificadas a pH 6,5 (condición de tampón de almacenamiento). Como se muestra en la Fig. 3, para prepro-DlPPO1 se midieron dos temperaturas de fusión (Tm) a 69,5 °C y 77,5 °C, mientras que pro-DlPPO1 exhibió tres valores de Tm (54,5 °C, 70,5 °C y 81,5 °C) hasta la completa desnaturalización de las enzimas. El despliegue de pro-DlPPO1 comenzó a una temperatura mucho más baja (~ 40 °C) (Fig. 3, Figura S9) que para prepro-DlPPO1 (~ 65 °C). La primera Tm resultante de pro-DlPPO1 es mucho más baja que los otros valores de Tm observados para ambas variantes de la enzima. Esto indica claramente que la pro-DlPPO1 latente exhibe cierto grado de despliegue limitado a una temperatura significativamente más baja que su precursor prepro-DlPPO1. Como la pro-DlPPO1 contiene solo dominios que también están presentes en la prepro-DlPPO1, parece que la inclusión de los péptidos señal en realidad aumenta la estabilidad térmica general de DlPPO1 y los péptidos señal ayudan a mantener la estabilidad de la proteína.

Estabilidad térmica de las variantes de DlPPO1 mediante ensayos de desplazamiento térmico. Los valores de temperatura de fusión (Tm) se determinaron a partir de la derivada de la intensidad de fluorescencia (I, en unidades arbitrarias) con respecto al incremento de temperatura. La prepro-DlPPO1 (línea azul) dio como resultado valores de Tm de 69,5 °C y 77,5 °C. La pro-DlPPO1 dio como resultado valores de Tm de 54,5 °C, 70,5 °C y 81,5 °C. Las intensidades de fluorescencia sin procesar se muestran en la Figura S9.

La activación de pro-DlPPO1 se controló mediante la conversión de tiramina (Figura S3) para verificar la concentración adecuada de SDS para superar la latencia de la enzima. La reacción se examinó usando 0,5 µg de pro-DlPPO1 y tiramina 8 mM como sustrato en MES 50 mM a pH 7,0 con varias concentraciones de SDS (0 a 1,5 mM). Como se muestra en la Figura S10, un aumento en la concentración de SDS de 0,00 a 0,25 mM provocó una mejora significativa de la actividad pro-DlPPO1, donde se logró la eficiencia de activación más alta con SDS 0,25 mM (28,3 ± 0,04 U mg−1). A concentraciones más altas de SDS, la actividad enzimática se redujo gradualmente. La pérdida de actividad a la mitad del óptimo se observó a una concentración de SDS de 1,25 mM. Por tanto, la concentración óptima de SDS para la activación de pro-DlPPO1 se definió como 0,25 mM y este nivel de activador añadido se aplicó en todos los experimentos posteriores. Se observó un comportamiento de activación cualitativamente idéntico para prepro-DlPPO1 (Figura S10).

La mayoría de las enzimas pierden sus actividades biológicas con el tratamiento con SDS, mientras que los PPO son resistentes al SDS hasta cierto punto, probablemente en parte debido a la existencia de enlaces disulfuro en la estructura55,76,77. SDS inicia la activación de las PPO mediante la introducción de cambios conformacionales en los extremos N y C de la forma latente que permiten la exposición del sitio activo y promueven el acceso al sustrato78. La activación de la PPO generalmente se logra a bajas concentraciones de SDS, mientras que las concentraciones más altas del detergente aniónico inhiben significativamente la actividad enzimática79,80, lo cual es consistente con el perfil de activación de SDS observado para DlPPO1. Se ha informado que el uso de SDS para la activación de PPO latentes es el mejor método de activación in vitro, ya que elimina casi por completo la latencia de las PPO de la planta y proporciona una actividad muy parecida a la PPO madura (después de la eliminación del dominio C-terminal) 66. El grado de activación de SDS varía mucho con los extractos de plantas78; por ejemplo, se requirió SDS de 0,13 mM para activar la PPO de patata latente (Solanum tuberosum)33, SDS de 0,35 mM para PPO de hongos (Agaricus bisporus)81, SDS de 0,69 mM para PPO de remolacha de mesa (Beta vulgaris)82, SDS de 2 mM para PPO de melocotón (Prunus persica cv. Paraguaya)83 y SDS 6,93 mM para mango PPO (Mangifera indica)84. Se ha demostrado que la concentración necesaria de detergente para la activación de la PPO de diente de león está determinada principalmente por los aminoácidos que forman la interfaz entre el dominio catalítico y el C-terminal85. El uso de SDS 0,25 mM para la activación de pro-DlPPO1 está en el extremo inferior en comparación con otras PPO expresadas heterólogamente como JrPPO1 de nuez (SDS 2 mM)67, SlPPO1 y SlPPO2 de tomate (SDS 1,5 mM)17, AbPPO4 de hongos (2 mM SDS)3 y para manzana MdPPO1 (3 mM), MdPPO2 (2 mM) y MdPPO3 (4 mM)66.

El pH es uno de los parámetros que afecta la actividad de un PPO86. Para optimizar el pH del tampón de reacción para la actividad pro-DlPPO1, la reacción enzimática se examinó a través de tampones MES y TRIS 50 mM con un rango de pH de 5,5 a 8,5 utilizando 0,5 µg de pro-DlPPO1, tiramina 8 mM como sustrato y SDS 0,25 mM. para la activación de la enzima. La Figura S11 demuestra que la enzima muestra diferentes grados de actividad en este rango de pH. La mayor actividad se mostró a pH 7,0 (28,3 ± 0,04 U mg−1) en tampón MES, mientras que la actividad disminuyó ligeramente a pH 6,5 en un 17 % y se redujo significativamente a pH 6,0 y 5,5 en un 61 % y un 86 %, respectivamente. Asimismo, la actividad disminuyó significativamente a un pH más alto (pH 7,5-8,5). Se observó una disminución del 43 % a pH 7,5 y del 74 % a pH 8,0. La actividad casi se agotó a pH 8,5 con una pérdida de actividad del 96% desde el óptimo. Anteriormente se informó un pH óptimo de 7,0 para las tirosinasas en manzana (MdPPO1 y MdPPO3)66 y hongos (AbPPO4)3. Se observó un pH óptimo ligeramente superior a 7,5 en MdPPO366. JrPPO1 y JrPPO2 de nuez tenían un pH óptimo más bajo de pH 6.067, mientras que la tirosinasa bacteriana de Streptomyces sp. de turberas (SzTYR) reveló un pH óptimo inusualmente alto de pH 9,0 como resultado de la adaptación a su entorno de pH natural68.

Primero se examinó el rendimiento catalítico de la pro-DlPPO1 utilizando cuatro sustratos estándar (Figura S3): se aplicaron dos monofenoles (tiramina, d-y l-tirosina) y dos difenoles (dopamina y l-DOPA) al pH óptimo de la enzima de 7,0 y una concentración de SDS de 0,25 mM. El pro-DlPPO1 acepta los cuatro sustratos estándar de las categorías monofenólica y difenólica y, en consecuencia, puede clasificarse como TYR (EC 1.14.18.1). Los valores de KM y kcat se calcularon mediante regresión no lineal y la especificidad del sustrato se estimó mediante la relación kcat/KM. Los datos informados sobre la especificidad del sustrato para pro-DlPPO1 se muestran en la Tabla 3 y la Figura S13. El sustrato difenólico dopamina se procesa más rápido (kcat: 260 ± 22 s−1) que la l-DOPA (kcat: 98 ± 8,5 s−1), y el monofenol tiramina (kcat: 35 ± 1,9 s−1) se hidroxila más rápido que l- o d-tirosina. Además, pro-DlPPO1 tiene un valor de KM más bajo para la dopamina (KM: 2,0 ± 0,35 mM), lo que da como resultado la mayor eficiencia catalítica (kcat/KM) entre los cuatro sustratos estándar probados. La relación kcat/KM para la dopamina es 4,6, 16, 336 y 504 veces mayor que la de la l-DOPA (28 ± 3,9 s−1 mM−1), la tiramina (8,2 ± 0,91 s−1 mM−1 ), d-tirosina (0,39 ± 0,016 s−1 mM−1) y l-tirosina (0,26 ± 0,016 s−1 mM−1), respectivamente (tabla 3). El prepro-DlPPO1 también acepta monofenoles estándar (tiramina y tirosina) y difenoles (dopamina y l-DOPA), pero con diferentes grados de eficiencia catalítica (Tabla 3 y Figura S14). La prepro-DlPPO1 se une a la dopamina con un valor de KM similar (KM: 2,3 ± 0,27 mM) al observado para la forma pro (KM: 2,0 ± 0,35 mM); sin embargo, la eficacia catalítica de prepro-DlPPO1 se reduce 7,5 veces en comparación con pro-DlPPO1 con una kcat/KM de 17 ± 2,4 s−1 mM−1. La conversión del difenol l-DOPA por prepro-DlPPO1 (kcat/KM de 12 ± 1,1 s−1 mM−1) fue 2,4 veces más lenta debido a la menor actividad catalítica (kcat: 40 ± 2,1 s−1) en comparación con pro-DlPPO1. Se observó una observación similar para los sustratos monofenólicos: la hidroxilación de tiramina (kcat/KM de 1,6 ± 0,14 s−1 mM−1) por prepro-DlPPO1 es 5,2 veces menos eficiente que para pro-DlPPO1 con un aumento concomitante de KM a 15 ± 1,0 mM y una actividad catalítica reducida (kcat: 24 ± 1,4 s−1). El examen cinético hacia los monofenoles l- y d-tirosina demostró una disminución de las relaciones kcat/KM, que son 1,3 y 1,6 veces más bajas que las observadas para pro-DlPPO.

Para obtener información sobre el comportamiento cinético de DlPPO1 en su entorno natural, una serie de sustratos fenólicos naturales ((–)-epicatequina, 4-metilcatecol, ácido cafeico, pirogalol, ácido gálico, quercetina, ácido vanílico y ácido ferúlico (Figura S2) ), todos los cuales han sido detectados en la cáscara, pulpa y semilla de longan39,40,41. Los datos que informan la especificidad de sustrato natural de pro-DlPPO1 se muestran en la Tabla 3 y la Figura S15. A través de los estudios cinéticos se reveló que pro-DlPPO1 es activo frente a los polifenoles (-)-epicatequina, 4-metilcatecol, ácido cafeico y pirogalol, mientras que la enzima se mostró completamente inactiva con el resto de sustratos ensayados. La mayor eficacia de pro-DlPPO1 se observó hacia la (–)-epicatequina (kcat: 270 ± 15 s−1) con una KM de 0,35 ± 0,052 mM, lo que resultó en kcat/KM de 800 ± 120 s−1 mM−1. Esta evidencia sugiere que es muy probable que (-) - epicatequina sea uno de los sustratos fisiológicos de DlPPO1 en longan. Las tasas de conversión de 4-metilcatecol, pirogalol y ácido cafeico fueron más bajas que para la (-)-epicatequina con valores de kcat/KM resultantes de 590 ± 99 s−1 mM−1, 70 ± 9,7 s−1 mM−1 y 4,3 ± 0,72 s−1 mM−1, respectivamente. Sin embargo, la eficiencia catalítica hacia estos sustratos naturales disminuyó significativamente en el prepro-DlPPO1. El examen cinético con (-)-epicatequina dio como resultado un valor de KM más alto (1,1 ± 0,12 mM), lo que indica que el precursor tiene una menor especificidad hacia este sustrato que pro-DlPPO1 (KM = 0,35 ± 0,052 mM). Por lo tanto, se observó que la eficiencia catalítica de prepro-DlPPO1 era solo de 33 ± 4,1 s-1 mM-1, que es 23 veces menor que el valor de pro-DlPPO1. Asimismo, la especificidad de la prepro-DlPPO1 a 4-metilcatecol, ácido cafeico y pirogalol es menor que la pro-DlPPO1 como lo indican los valores de KM más altos en comparación con la pro-DlPPO1. Los datos que informan la especificidad del sustrato natural de prepro-DlPPO1 se muestran en la Tabla 3 y la Figura S16. Los valores kcat/KM resultantes de 17 ± 1,7 s−1 mM−1 (4-metilcatecol), 2,5 ± 0,20 s−1 mM−1 (ácido cafeico) y 15 ± 1,2 s−1 mM−1 (pirogalol) indican que la eficacia catalítica de la prepro-DlPPO1 disminuyó 36, 1,7 y 4,7 veces, respectivamente, con respecto a la pro-DlPPO1. Por lo tanto, el componente de péptido señal podría ser uno de los factores responsables de la tasa reducida de PPO al catalizar la oxidación e hidroxilación de compuestos fenólicos.

Con concentraciones de (–)-epicatequina superiores a 2 mM, la conversión enzimática fue más lenta que la tasa observada a niveles de sustrato más bajos tanto para prepro-DlPPO1 como para pro-DlPPO1 (Figuras S15A y S16A). La inclusión de la inhibición competitiva por parte del propio sustrato ("inhibición del sustrato", Ecuación S3) en el modelo de Michaelis-Menten permitió expandir el rango de concentración modelado hasta 3 mM para pro-DlPPO1 y hasta 5 mM para prepro-DlPPO1. Cambiar el modelo matemático de conversión enzimática provoca cambios importantes en los parámetros cinéticos obtenidos. Para pro-DlPPO1 (KM = 4,6 ± 2,0 mM, kcat = 1500 ± 590 s−1, Ki = 0,56 ± 0,26 mM) así como para prepro-DlPPO1 (KM = 6,1 ± 3,7 mM, kcat = 140 ± 72 s− 1, Ki = 1,2 ± 0,79 mM), tanto KM como kcat aumentan significativamente (compárese con la Tabla 3) para compensar el efecto inhibidor recién introducido del propio sustrato (Ki), mientras que las variaciones de todos los parámetros ajustados están seriamente infladas en relación con el simple Modelo de Michaelis-Menten. Para pro-DlPPO1 y dopamina (Figura S13C; KM = 1,2 ± 0,11 mM, kcat = 250 ± 15 s−1, Ki = 30 ± 7,3 mM), con una Ki mucho más alta que indica una inhibición del sustrato menos eficiente, la inflación de los parámetros Las varianzas son menos severas y tanto kcat como Km son ligeramente más bajas que con el modelo simple de Michaelis-Menten.

Se informó que el centro de cobre binuclear de las OPP funciona enantioselectivamente32. Se investigó la enantioselectividad de la reacción catalítica de pro-DlPPO1 sobre tirosina. La enzima mostró preferencia por la d-tirosina con una eficiencia catalítica ligeramente mayor de 0,39 ± 0,016 s−1 mM−1 sobre el enantiómero L (0,26 ± 0,016 s−1 mM−1). 1 mM de d-tirosina se convierte a una velocidad de 0,11 ± 0,01 U mg−1, que es 1,1 veces más rápida que la velocidad de conversión de l-tirosina por pro-DlPPO1. El efecto de la quiralidad del sustrato también se observó en el hongo AbPPO4, donde la l-tirosina fue ligeramente más preferible que la d-contraparte3. La tirosinasa producida por Streptomyces sp. REN-21 reaccionó 35,9 veces más rápido con la l-tirosina que con la d-tirosina, que es el efecto de enantioselectividad más fuerte sobre el sustrato tirosina entre los PPO que se ha informado87. La preferencia por un sustrato de estereoisómero d también se informó en una PPO purificada de berenjena (Solanum melongena), en la que la conversión de d-DOPA 0,1 mM fue 1,8 veces más rápida que la de l-DOPA88. Otro ejemplo de la reacción enantioespecífica en PPO de plantas se encuentra en la larreatricina hidroxilasa de Larrea tridendata (LtPPO) que exhibe una preferencia pronunciada (23 veces) por (+)-larreatricina en comparación con el enantiómero (–), mientras que en el mismo El estudio AbPPO4 revela un efecto contrario al preferir la (–)-larreatricina (13 veces)32.

La prepro-DlPPO1 y la pro-DlPPO1 se examinaron espectrofotométricamente usando H2O2 para evaluar la formación del estado oxi de la enzima en presencia de oxígeno. La adición de H2O2 a la prepro-DlPPO1 conduce a un aumento de la banda de absorción específica (~ 345 nm), lo que es indicativo de la característica de forma oxi inducida por oxígeno para las enzimas del centro de cobre tipo III y se ha atribuido a la transferencia de carga transición de \({\text{O}}_{2}^{2 - } \left( {\pi_{\sigma }^{*} } \right) \a {\text{Cu}}\left( {II} \right)_{{d_{{x^{2} - y^{2} }} }}\)89. Se hizo una observación similar con pro-DlPPO1, donde la formación de oxiaductos dio como resultado la formación de una banda de absorción pronunciada a 345 nm (Fig. 4). La absorción a 345 nm se saturó cuando la titulación alcanzó ~ 150 equivalentes de H2O2 para prepro-DlPPO1 y ~ 175 equivalentes de H2O2 para pro-DlPPO1, respectivamente. Los coeficientes de absorción resultantes son ~ 9000 M-1 cm-1 por mol de enzima para la prepro-DlPPO1 y ~ 10 300 M-1 cm-1 por mol de enzima para la pro-DlPPO1. La formación de la forma oxi por H2O2 se ha demostrado previamente para PPO extraídos de fuentes naturales60,90,91. Las catecol oxidasas purificadas de toronjil (Melissa officinalis)86, camote (Ipomoea batatas)87 y hojas de nogal (Juglans regia)52 dieron como resultado una saturación completa de la forma oxi cuando se agregaron dos equivalentes de H2O2. En gitana (Lycopus europaeus) catecol oxidasa, se requirieron 6 equivalentes de H2O2 para saturar la banda λ345, mientras que en álamo negro (Populus nigra)89 se necesitaron 80 equivalentes de H2O2. Se informó que SlPPO1 y SlPPO2 expresados ​​heterólogamente de Solanum lycopersicum17 generan la forma oxi totalmente saturada con 25 y 11 equivalentes de adición de H2O2, respectivamente. Además, la adición de H2O2 indujo la CgAUS de tipo salvaje de Coreopsis grandiflora que se expresó heterólogamente en E. coli para formar completamente un oxiaducto a 24 equivalentes de H2O292,93. El presente estudio es el primero en investigar la formación en forma de oxi de una prepro-PPO expresada heterólogamente que todavía tiene sus péptidos señal unidos.

Espectros UV/Vis de pro-DlPPO1 y prepro-DlPPO1 después del tratamiento con H2O2. (A) Espectros generales de pro-DlPPO1 después del tratamiento con H2O2. El recuadro muestra la absorción a 345 nm frente a los equivalentes agregados de H2O2. (B) Espectros generales de prepro-DlPPO1 después del tratamiento con H2O2. El recuadro muestra la absorción a 345 nm frente a equivalentes de H2O2. (C) Vista ampliada de los espectros a 300-400 nm de la pro-DlPPO1 después del tratamiento con H2O2. (D) Vista de primer plano de los espectros a 300–400 nm de la prepro-DlPPO1 después del tratamiento con H2O2.

Se realizaron estudios de acoplamiento molecular para proporcionar más información sobre las interacciones enzima-sustrato de la pro-DlPPO1. Los estudios de simulación se realizaron con el software AutoDock Vina94. El modelo estructural de pro-DlPPO1 se preparó como se describe en Materiales y Métodos y se usó para los cálculos computacionales. Las poses de unión se calcularon para todos los sustratos investigados (Figuras S17 y S18) y se validaron de acuerdo con la estructura TYR de Bacillus megaterium que contiene el sustrato l-tirosina unido al sitio activo sustituido con Zn (PDB: 4P6R)1. Los resultados proporcionaron información detallada sobre la supuesta posición de los sustratos investigados y las energías de enlace de estas poses alrededor del centro activo (Tabla S3). El sustrato natural (-)-epicatequina exhibió la afinidad de unión más fuerte entre los sustratos investigados, como lo sugiere fuertemente la KM medida más baja (KM = 0.35 ± 0.052 mM) y la energía de unión más favorable (Tabla S3). La mayor eficiencia catalítica en combinación con los valores de KM similares del 4-metilcatecol y el ácido cafeico indican que el 4-metilcatecol forma un complejo más estable con DlPPO1 que el ácido cafeico. Pyrogallol presenta la KM más alta entre los sustratos naturales probados, lo que sugiere interacciones de unión débiles entre pro-DlPPO1 y el sustrato. La mayor eficiencia catalítica que la observada para el ácido cafeico se debe al valor de kcat mucho más alto del pirogalol (Tabla 3).

Un análisis posterior con LiqPlot + de (–)-epicatequina acoplada al centro activo de DlPPO1 reveló las interacciones específicas del sustrato con los aminoácidos alrededor del centro activo de dicopper. Específicamente, uno de los dos grupos hidroxi en el anillo o-difenólico de la (–)-epicatequina (Fig. 5) establece dos enlaces de hidrógeno; uno con el nitrógeno de imidazol del His243 coordinante de cobre conservado (2,8 Å) y el segundo con el grupo carboxílico del esqueleto de Met257 (2,8 Å). El segundo grupo hidroxi del mismo anillo interactúa con los dos iones de cobre y está bien posicionado para la reacción oxidativa (CuA: 4,1 Å y CuB: 3,7 Å, respectivamente). Además, nueve interacciones hidrofóbicas con los residuos His87, Asn109, Ala231, Glu235, Asn236, Gly258, Asn259, Phe260 y Ala263 cubren todo el cuerpo del sustrato (Fig. 5). Al igual que otros PPO de plantas, el Phe26017 conservado, el residuo guardián, se convierte en el anillo fenólico de la (-)-epicatequina y forma interacciones tipo sándwich π-π. La unión de alta afinidad de la (–)-epicatequina muestra la preferencia de las PPO vegetales por los metabolitos secundarios fenólicos y sugiere fuertemente que la (–)-epicatequina sea un sustrato fisiológico de DlPPO1. Resultados similares se han presentado para la PPO de tomate (SlPPO1) que tiene una alta afinidad hacia la dihidrocalcona floretina17 y para la aurona sintasa de Coreopsis grandiflora para la cual se propuso la buteína como sustrato natural51,95.

Acoplamiento de (–)-epicatequina a DlPPO1. (A) Pose de unión de (–)-epicatequina en el centro activo de DlPPO1. (B) Gráfica de interacción de DlPPO1 y (–)-epicatequina. Códigos de color: el texto magenta representa residuos que forman enlaces de hidrógeno y el texto verde oliva marca residuos que exhiben interacciones hidrofóbicas. En la (–)-epicatequina, así como en los dos aminoácidos que forman enlaces de hidrógeno, los átomos de carbono se muestran como círculos negros, los átomos de oxígeno se dibujan en rojo, los átomos de nitrógeno se muestran en azul y el átomo de azufre único está presente en el diagrama de interacción está resaltado en naranja.

En este trabajo, se expresó, purificó y caracterizó prepro-DlPPO1 de D. longan en comparación con pro-DlPPO1. Este constituye el primer informe sobre las diferencias bioquímicas entre una PPO expresada en un sistema procariótico con y sin su secuencia señal N-terminal. La titulación con H2O2 monitoreada por espectroscopía UV-Vis verificó que DlPPO1 contiene un centro de cobre tipo III. Después de la adición de ~ 150 y ~ 175 equivalentes de H2O2, la banda de absorción alrededor de 345 nm que indica la forma oxi se desarrolló completamente en prepro-DlPPO1 y pro-DlPPO1, respectivamente (Fig. 4). Los experimentos cinéticos mostraron que ambas enzimas aceptan sustratos monofenólicos, por lo que ambas formas de DlPPO1 se clasificaron como tirosinasas (EC. 1.14.18.1). El pro-DlPPO1 exhibió valores más bajos de KM y más altos de kcat y, en consecuencia, eficiencias cinéticas mucho más altas, hacia todos los sustratos probados que el prepro-DlPPO1 (Tabla 3). Los péptidos señal N-terminal parecen proporcionar una barrera eficaz para la unión del sustrato al sitio activo de DlPPO1. La inclusión de los péptidos señal supuestamente desplegados dio como resultado una tolerancia térmica sustancial de prepro-DlPPO1 que incluso supera la estabilidad térmica de pro-DlPPO1 (Fig. 3). En combinación con el efecto de impedimento de los péptidos señal sobre la función catalítica de DlPPO1, la mayor termoestabilidad que le confieren a DlPPO1 puede indicar una estructura más ordenada y compacta de estos péptidos como se prevé actualmente. (–)-Epicatequina exhibió la KM más baja, la eficiencia catalítica más alta (Tabla 3), la unión más favorable a DlPPO1 (Tabla S3 y Fig. 5) y también la inhibición de sustrato más severa entre todos los sustratos investigados. Los resultados sugieren (–)-epicatequina como sustrato fisiológico de DlPPO1. Este trabajo proporciona información sobre las propiedades bioquímicas y catalíticas de longan PPO que serán útiles para futuras intervenciones posteriores a la cosecha para el manejo efectivo de las costosas reacciones de pardeamiento de la fruta.

A menos que se especifique lo contrario, todos los productos químicos usados ​​se compraron a Sigma-Aldrich (Viena, Austria) o Carl-Roth (Karlsruhe, Alemania) y eran al menos de grado analítico. Las enzimas para la manipulación de ácidos nucleicos fueron de New England Biolabs (NEB; Frankfurt am Main, Alemania) o Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, EE. UU.).

Las hojas de longan se recolectaron en Lamphun (18.481174° N, 99.176014° E), ubicada en la parte norte de Tailandia, se transportaron inmediatamente al laboratorio y se almacenaron a -80 °C. Se obtuvo permiso del propietario local para recolectar hojas de longan con fines de investigación. Hojas sanas se trituraron en nitrógeno líquido y se aisló el ARN total por el método Rapid CTAB según Gambino et al.96 con un tampón de extracción que contenía 2%(m/v) de bromuro de cetiltrimetilamonio, 2,5%(m/v) de polivinilpirrolidona, 2 NaCl M, Tris-HCl 100 mM (pH 8,0), ácido etilendiaminotetraacético (EDTA, ajustado a pH 8,0 con NaOH) 25 mM y β-mercaptoetanol al 2 % (v/v). Posteriormente, se sintetizó ADNc utilizando un cebador poli-T (5'-T25VN-3') y transcriptasa inversa del virus de la leucemia murina de Moloney. Se diseñaron cebadores específicos para el gen longan PPO (prepro-DlPPO1 y pro-DlPPO1) (Tabla S2). Los cebadores se usaron para amplificar los genes PPO de la plantilla de ADNc usando la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 (NEB). Los productos de la PCR se clonaron en el vector de expresión pGEX-6P-SG69 mediante el siguiente procedimiento: el vector pGEX-6P-SG (1 fmol) se incubó con 5 fmol del amplicón prepro-DlPPO1 purificado o 5 fmol del pro-DlPPO1, 6 trifosfato de adenosina (ATP) mM, 4 unidades de Esp3I (Thermo Fisher Scientific) y 160 unidades de ADN ligasa T4 (NEB) en un volumen total de 6 μL 1 × tampón CutSmart (NEB) durante 90 min a 30 °C, seguido por inactivación enzimática a 65 °C durante 20 min. Los plásmidos obtenidos se transformaron en células SHuffle T7 Express (NEB) químicamente competentes. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar LB suplementadas con 100 mg L−1 de ampicilina mediante incubación a 37 °C durante la noche. Los clones positivos se detectaron con PCR de colonias y se verificaron mediante secuenciación de Sanger, realizada por Microsynth GmbH (Viena, Austria).

En los plásmidos recombinantes, los genes prepro-DlPPO1 y pro-DlPPO1 están fusionados en el extremo N con la etiqueta GST del vector pGEX-6P-SG. La secuencia de reconocimiento de la proteasa 3C del rinovirus humano (HRV3C) (LEVLFQ|GP) se encuentra entre la etiqueta GST y el gen objetivo, lo que permite la disociación proteolítica controlada de la etiqueta de la proteína de interés tras la purificación. Los dos genes de fusión (GST-prepro-DlPPO1 y GST-pro-DlPPO1) se sobreexpresaron eficientemente utilizando el promotor tac sintético del vector pGEX-6P-SG. La cepa SHuffle T7 Express E. coli se cultivó en un medio 2xYT modificado (triptona-peptona al 1,6 % (m/v), extracto de levadura al 1 % (m/v), NaCl al 1 % (m/v), NaCl al 0,5 % (m /v) NH4Cl, glicerol al 0,5 % (v/v), MgCl2 2 mM, CaCl2 1 mM, ajustado a pH 7,5) en presencia de ampicilina (100 mg/L). Los cultivos durante la noche se cultivaron a 37 °C. Los lotes de expresión se inocularon con los cultivos saturados durante la noche y se cultivaron (empezando con una OD600 de 0,05) a la misma temperatura durante ~ 4 h hasta que la OD600 alcanzó un valor de 0,6–0,8. Para optimizar la cantidad de proteína y, al mismo tiempo, evitar la formación de cuerpos de inclusión, la temperatura se redujo a 17,5 °C para la expresión. Los cultivos se indujeron con IPTG 0,5 mM y se añadieron CuSO4 2,0 ​​mM. Los cultivos de expresión permanecieron a 17,5 °C bajo agitación durante 48 h. Cuando la DO600 alcanzó un valor de 7–10, los cultivos se recolectaron por centrifugación a 6500 × g durante 25 min a 4 °C.

La lisis celular se realizó aplicando la técnica de congelación-descongelación utilizando nitrógeno líquido. Los sedimentos se resuspendieron en tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, pH 7,5, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM y sacarosa 50 mM). Se añadieron lisozima (0,5 g/l) e inhibidores de proteasa (fluoruro de fenilmetilsulfonilo 1 mM y benzamidina 1 mM) para lisar las paredes celulares bacterianas y para evitar la degradación de proteínas por proteasas endógenas, respectivamente. Las suspensiones se agitaron y se incubaron en hielo durante 45 min. Luego, las mezclas se sometieron a cinco ciclos de congelación en nitrógeno líquido, alternando con descongelación en un baño de agua a 25 °C. Después de la quinta ronda del procedimiento de congelación y descongelación, se añadieron MgCl2 2 mM y DNasaI 0,02 g/L para eliminar la viscosidad de las soluciones provocada por el ADN que se liberaba de las células bacterianas y para mejorar la extracción de proteínas. Posteriormente, los lisados ​​​​se centrifugaron a 7500 × g durante 1 h a 4 ° C.

Las purificaciones cromatográficas se realizaron con un purificador ÄKTA (GE Healthcare) colocado en un refrigerador a 4 °C. Los lisados ​​​​filtrados se colocaron en un circuito de inyección de 50 ml y se aplicaron en una columna GSTrap FF de 5 ml preempaquetada utilizando una solución de Tris-HCl 50 mM, NaCl 250 mM pH 7,5 como tampón de unión. Las proteínas de fusión GST objetivo quedaron atrapadas en la columna, mientras que las proteínas no unidas fueron eliminadas por el tampón de unión aplicado a un caudal de 1 ml/min y el tampón de lavado de chaperonas (Tris-HCl 50 mM, NaCl 250 mM, MgCl2 10 mM y Na-ATP 5 mM ajustado a pH 8; aplicado para 15 volúmenes de columna) para eliminar las chaperonas de unión de las proteínas de fusión diana. Finalmente, las proteínas deseadas se eluyeron con Tris-HCl 50 mM, NaCl 250 mM y glutatión reducido 15 mM ajustado a pH 7,5. Las fracciones de proteína de fusión GST se agruparon y concentraron utilizando un dispositivo de ultracentrifugación Vivaspin con un límite de peso molecular de 30 kDa (Sartorius; Göttingen, Alemania). Para eliminar el glutatión, el tampón se cambió luego a Tris-HCl 50 mM pH 7,5 y NaCl 250 mM. Posteriormente, las muestras se mezclaron con una proteasa GST-HRV3C preparada internamente3 en una relación de masa de 1:50 (proteasa: proteína de fusión GST). La proteólisis se llevó a cabo durante 48 h a 4 °C. Posteriormente, las proteínas escindidas se aplicaron nuevamente en una columna GSTrap FF de 5 ml. En este momento, la proteína GST y la proteasa etiquetada con GST quedaron atrapadas en la columna, mientras que las PPO pudieron fluir a través de la columna y se eluyeron inmediatamente. Las fracciones proteicas de prepro-DlPPO1 y pro-DlPPO1 se recogieron, concentraron y almacenaron en MES 100 mM y NaCl 200 mM pH 6,5 con glicerol al 30 % (v/v) a -80 °C. Las concentraciones de proteína se determinaron utilizando la ley de Beer-Lambert97 basada en la absorción a 280 nm y el coeficiente de extinción proporcionado por ExPASy ProtParam98. La masa molecular predicha de las proteínas expresadas se estimó a partir del peso atómico y la composición isotópica estándar de los elementos constituyentes74. Los contenidos de cobre de las enzimas prepro-DlPPO1 y pro-DlPPO1 se evaluaron fotométricamente después de acidificar con ácido acético y reducir Cu(II) a Cu(I) con ascorbato, lo que permitió la quelación de Cu(I) por 2,2′. -biquinolina según el método publicado por Hanna et al.73.

La determinación de masas de prepro-DlPPO1 y pro-DlPPO1 se realizó con un espectrómetro de masas ESI-LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Fisher Scientific Bremen, Alemania) con un rango de masas de 200–4000 m/z y una precisión de masa cercana a 3 ppm con calibración. Antes de la EM, se intercambiaron 100 µg de las soluciones de proteína en tampón de acetato de sodio 5 mM (pH 7,0). Las soluciones de proteínas se diluyeron 100 veces en una mezcla de acetonitrilo al 80 % (v/v) y ácido fórmico al 0,1 % (v/v) inmediatamente antes de aplicarlas al espectrómetro de masas.

La SDS-PAGE desnaturalizante se realizó como describen Laemmli et al.99 en un aparato de mini gel (Mini-PROTEAN Tetra Cell, Bio-Rad). El prepro-DlPPO1 y pro-DlPPO1 se diluyeron en tampón de carga de gel que contiene 30 g/L de SDS, 6 % (v/v) de glicerol, 75 mM Tris, 2,5 % (v/v) de 2-mercaptoetanol y 50 mg/L azul de bromofenol ajustado a pH 6,8. Las muestras se calentaron a 99 °C (Thermomixer comfort, Eppendorf) durante 5 minutos para ayudar en la desnaturalización. Luego, las muestras se aplicaron en geles de poliacrilamida de apilamiento al 5 % y de resolución al 11 % junto con un estándar de peso molecular (Precision Plus Protein Standard Dual Color, Bio-Rad) para proporcionar información sobre el tamaño y la pureza de las proteínas. La electroforesis se realizó a 120 V. Los geles se tiñeron en una solución de colorante (200 mg/L de azul brillante de Coomassie G-250, 50 g/L de Al2(SO4)3.16 H2O, 10 % (v/v) de etanol y 20 g/L de H3PO4) y posteriormente se destiñeron con etanol al 10% (v/v) y ácido ortofosfórico 20 g/L. Se tomaron fotografías de los geles usando el sistema de imágenes BioRad Gel Doc XR.

El ensayo de desplazamiento térmico se realizó para medir los puntos de fusión de las dos isoenzimas en el tampón de almacenamiento (MES 50 mM pH 6,5 y NaCl 200 mM) para determinar la estabilidad de los dos estados de la enzima. El ensayo se realizó tres veces usando tubos de PCR (Axygen, INC Corning) en un instrumento de PCR en tiempo real (mastercycler ep-realplex, Eppendorf). Las soluciones de reacción contenían enzima 10 µM y 4 × SYPRO Orange (Sigma-Aldrich) en el tampón de almacenamiento. Las muestras se calentaron gradualmente con un incremento de un K por minuto de 4 °C a 94 °C en la máquina de PCR, mientras que el cambio en la intensidad de la fluorescencia se controló a 560 nm después de la excitación a 470 nm. Las intensidades de fluorescencia resultantes de las soluciones que contenían cada enzima se representaron luego frente a la temperatura para el análisis de estabilidad.

Las actividades de DlPPO1 se determinaron espectrofotométricamente controlando el aumento de absorbancia a 480 nm tras la conversión de tiramina por la enzima. Las mediciones estándar se realizaron usando 0,5 µg de la enzima y 8 mM de tiramina en un volumen de reacción total de 200 µL con la concentración de SDS óptima determinada (0,25 mM) para activar prepro-DlPPO1 o pro-DlPPO. En ausencia de SDS, no se obtuvieron curvas de tiempo de absorción utilizables para los sustratos probados (Figura S12). Las curvas de absorción y los espectros se registraron a 25 °C en una microplaca de 96 pocillos aplicando un TECAN infinite M200 (Tecan). Las actividades se determinaron a partir de la pendiente de la parte lineal inicial de las curvas experimentales (absorbancia frente al tiempo) y se expresaron como U/min. Una unidad de actividad enzimática (U) se definió como la cantidad de enzima que catalizaba la formación de 1 μmol de quinonas por minuto (1 U = 1 μmol/min). Todos los ensayos se realizaron por triplicado. Las optimizaciones de la concentración de SDS y el pH del tampón de reacción hacia la actividad pro-DlPPO1 son las siguientes (vide infra).

Las mediciones (200 µL) se realizaron en presencia de varias concentraciones de SDS (0,00, 0,05, 0,10, 0,25, 0,50, 0,75, 1,00, 1,25 y 1,50 mM) usando 0,5 µg de pro-DlPPO1 y tiramina 8 mM en MES 50 mM a pH 7,0. La concentración óptima de SDS se utilizó posteriormente en todos los demás estudios siguientes.

Se utilizó una serie de tampones MES y Tris en un rango de pH de 5,5 a 8,5 como tampón de reacción para determinar el pH más favorable que proporciona la mejor actividad enzimática para estudios cinéticos adicionales. Cada reacción (200 µL) se llevó a cabo con una concentración de tampón de 50 mM utilizando 0,5 µg de pro-DlPPO1, tiramina 8 mM y la concentración óptima de SDS obtenida del experimento anterior.

La especificidad de sustrato de prepro-DlPPO1 y pro-DlPPO1 se probó utilizando varios sustratos fenólicos. Los sustratos que dieron como resultado actividades decentes se seleccionaron posteriormente para determinar los parámetros cinéticos. Las actividades se evaluaron espectrofotométricamente en dos sustratos monofenólicos estándar (tiramina, l- y d-tirosina), dos compuestos difenólicos estándar (dopamina y l-DOPA) y cuatro sustratos fenólicos naturales ((–)-epicatequina, 4-metilcatecol, pirogalol y caféico). ácido). Las curvas de absorción de los productos coloreados se monitorearon en un TECAN infinite M200 para diferentes molaridades del sustrato respectivo. La mezcla de reacción (volumen total de 200 µL) contenía cantidades variables de la enzima (consulte la Tabla S4, almacenada en MES 100 mM y NaCl 200 mM a pH 6,5) y SDS 0,25 mM en la solución de reacción de tampón MES 50 mM a pH 7 Los coeficientes de absorción molar (ɛλmax) de los cromóforos formados se informan en la Tabla S4 y la Figura S19. Para realizar los experimentos cinéticos, se eligieron entre 7 y 8 concentraciones de sustrato en torno a un valor de KM preliminar si la solubilidad limitada del sustrato lo permitía (Figuras S13-S16). Los valores de KM y vmax se calcularon mediante regresión no lineal utilizando el algoritmo de Levenberg-Marquardt100 que se suministró con valores iniciales para los parámetros del modelo derivados de la aplicación de la linealización de Hanes-Woolf101 de la ecuación de Michaelis-Menten (Ecuación S1). La tasa de rotación máxima (kcat, Ecuación S2) se evaluó dividiendo el número total de moléculas de sustrato que se convirtieron por minuto por el número total de moléculas de enzima presentes en el volumen de reacción. Para las combinaciones de enzima y sustrato que muestran inhibición del sustrato, la ecuación de Michaelis-Menten se amplió para incluir la inhibición por parte del sustrato (Ecuación S3).

La prepro-DlPPO1 y la pro-DlPPO1 se investigaron espectrofotométricamente usando H2O2 que induce la formación del estado oxi característico de las enzimas de cobre tipo III102. La adición de H2O2 al prepro-DlPPO1 o pro-DlPPO1 conduce a la formación de una nueva banda de absorción alrededor de ~ 345 nm que es característica del estado de oxígeno inducido por peróxido del centro dicopper87. En estos experimentos, se mezclaron 255 µg de pro-DlPPO1 (ε280 = 74 300 M−1 cm−1) o 300 µg de prepro-DlPPO1 (ε280 = 74 425 M−1 cm−1) en 200 µL del tampón de almacenamiento (100 mM MES y NaCl 200 mM pH 6,5). Se agregaron varios equivalentes de H2O2 a la solución hasta que se alcanzó la saturación del pico característico a ~ 345 nm. Después de cada adición de otro equivalente de H2O2 a la enzima investigada, se permitió suficiente tiempo (pero al menos 5 minutos) hasta que la absorción a la longitud de onda característica de 345 nm fuera estable y solo entonces se agregó el siguiente equivalente de H2O2. La medición finalizó cuando el pico característico (~ 345 nm) no aumentó más con H2O2 adicional.

La secuencia de aminoácidos de la pro-DlPPO1 (Ala1-Asp503) se envió al servidor SWISS-MODEL103,104. Al principio, la tubería buscó una plantilla apropiada de la secuencia investigada (OU702517) basada en BLAST105 y HHblits106. La búsqueda dio como resultado MdPPO166, Malus domestica TYR 1 (PDB: 6ELS)35,36, como el acierto que exhibió el valor de cobertura más alto (0,86, con 69,80 % de identidad de secuencia). A continuación, se creó el modelo de homología final de la pro-DlPPO1 utilizando la estructura 6ELS como plantilla y la visualización se realizó mediante el sistema gráfico PyMol Molecular (Schrödinger, LLC)107.

El acoplamiento molecular se realizó mediante el software AutoDock Vina94. Se utilizaron estudios de acoplamiento para identificar las poses de unión de los sustratos naturales investigados (-)-epicatequina, 4-metilcatecol, ácido cafeico, pirogalol y los sustratos estándar dopamina, l-DOPA, tiramina, l-tirosina y d-tirosina en el dicopper. centro activo de pro-DlPPO1. El modelo molecular de pro-DlPPO1 se preparó para acoplamiento molecular como se describió anteriormente para MdPPO166. Específicamente, de la estructura putativa de pro-DlPPO1 se eliminó el dominio C-terminal (Pro336-Asp503) y solo se usó el dominio activo (Ala1-Val335) para los estudios de acoplamiento. Además, el residuo gatekeeper (Phe260) se definió como un residuo flexible, ya que su flexibilidad ha sido verificada para PPO de plantas17. La estructura de todos los sustratos se descargó del servidor PubChem108, luego se tradujo al formato 3D pdb y se convirtió en archivos pdbqt usando AutoDockTools (ADT, v. 1.5.6)109. Para todos los sustratos se eligió el mayor número posible de torsiones activas. ADT asignó hidrógenos polares a las estructuras y también se guardaron en los archivos pdbqt del sustrato. En todos los experimentos, la cuadrícula de búsqueda se centró en el medio de los dos iones de cobre del sitio activo y se extendió sobre un cubo (12 × 12 × 12 Å3, espacio entre puntos de la cuadrícula: 1 Å) con bordes paralelos a los tres ejes de coordenadas del modelo objetivo DlPPO1. A continuación, se utilizó AutoDock/Vina para el acoplamiento mediante el suministro de las enzimas e inhibidores investigados junto con las propiedades de la caja de cuadrícula en el archivo de configuración. Para todas las mediciones, el rango de energía se estableció en 5, mientras que la exhaustividad se estableció en 50. Al acoplar, las poses de unión se evaluaron superponiendo el sustrato cocristalizado l-tirosina de la estructura cristalina BmTYR (PDB: 4P6R)1. Las posturas que se desviaban mucho de la postura de unión de la l-tirosina en la estructura BmTYR (es decir, las posturas del sustrato con el anillo fenólico que no interactúa con el centro dicopper) se caracterizaron como posturas "irrazonables". Las configuraciones de acoplamiento razonables (el anillo fenólico vinculado a los iones de cobre similares a BmTYR (PDB: 4P6R)1) se trazaron como una imagen 3D usando el software de visualización PyMol Molecular graphic system (Schrödinger, LLC)107.

Después del estudio de acoplamiento, las poses de enlace razonables de interés se guardaron como archivos pdb y se visualizaron más utilizando el software LigPlot +110,111 para evaluar las interacciones entre el ligando (-)-epicatequina y los residuos de aminoácidos que interactúan alrededor del centro activo. Los parámetros de tiempo de ejecución se definieron según lo sugerido por el software. Específicamente, se permitieron enlaces de hidrógeno hasta un rango máximo de 2,70 Å entre un hidrógeno y un aceptor de hidrógeno y también hasta un rango máximo de 3,35 Å entre un donante de hidrógeno y un aceptor de hidrógeno. Los parámetros de contacto sin enlace se definieron como distancias máximas de 2,90 Å entre los carbonos hidrofóbicos del ligando y la proteína y de 3,90 Å entre los átomos de azufre del ligando y la proteína.

Todos los experimentos con plantas descritos en este estudio cumplieron con las directrices y leyes institucionales, nacionales e internacionales pertinentes.

Las secuencias generadas y analizadas durante el estudio presentado están disponibles en el repositorio del Archivo Europeo de Nucleótidos (ENA) con las entradas OU702517 (gen pro-DlPPO1 parcial) y OU702518 (gen prepro-DlPPO1).

Goldfeder, M., Kanteev, M., Isaschar-Ovdat, S., Adir, N. & Fishman, A. La determinación de los modos de unión al sustrato de tirosinasa revela diferencias mecánicas entre las proteínas de cobre tipo 3. Nat. común 5, 1–5. https://doi.org/10.1038/ncomms5505 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Mauracher, SG et al. La purificación de proteínas de alto nivel permite la determinación inequívoca de polipéptidos de la isoforma PPO4 latente de la tirosinasa de hongos. Fitoquímica 99, 14–25. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2013.12.016 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Pretzler, M., Bijelic, A. & Rompel, A. Expresión heteróloga y caracterización de la tirosinasa de hongo funcional (AbPPO4). ciencia Rep. 7, 1–10. https://doi.org/10.1038/s41598-017-01813-1 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Kim, H. et al. Una tirosinasa adaptada al frío con una relación de actividad monofenolasa/difenolasa anormalmente alta que se origina en la arquea marina Candidatus Nitrosopumilus koreensis. Biotecnología. Letón. 38, 1535–1542. https://doi.org/10.1007/s10529-016-2125-0 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mayer, AM Polifenol oxidasas en plantas y hongos: ¿Llegando a lugares? Una revisión. Fitoquímica 67, 2318–2331. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2006.08.006 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Li, Y., Wang, Y., Jiang, H. y Deng, J. La estructura cristalina de la profenoloxidasa de Manduca sexta proporciona información sobre el mecanismo de las enzimas de cobre tipo 3. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 106, 17002–17006. https://doi.org/10.1073/pnas.0906095106 (2009).

Artículo ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lu, A. et al. Profenoloxidasa de insectos: la visión más allá de la inmunidad. Frente. Fisiol. 5, 1–15. https://doi.org/10.3389/fphys.2014.00252 (2014).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Lai, X., Soler-Lopez, M., Wichers, HJ & Dijkstra, BW Expresión recombinante a gran escala y purificación de tirosinasa humana adecuada para estudios estructurales. PLoS ONE 11, 1–16. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0161697 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Lai, X., Wichers, HJ, Soler-Lopez, M. & Dijkstra, BW La estructura de la proteína 1 relacionada con la tirosinasa humana revela un sitio activo de zinc binuclear importante para la melanogénesis. Angew. química En t. ed. 56, 9812–9815. https://doi.org/10.1002/anie.201704616 (2017).

Artículo CAS Google Académico

Sánchez-Ferrer, Á., Rodríguez-López, J. N., Garcia-Cánovas, F. & Garcia-Carmona, F. Tyrosinase: A comprehensive review of its mechanism. Biochim. Biophys. Acta 1247, 1–11. https://doi.org/10.1016/0167-4838(94)00204-t (1995).

Artículo PubMed Google Académico

Bijelic, A., Pretzler, M., Molitor, C., Zekiri, F. & Rompel, A. La estructura de una tirosinasa vegetal de hojas de nuez revela la importancia de los "residuos de guía del sustrato" para la especificidad enzimática. Angew. química En t. ed. 54, 14677–14680. https://doi.org/10.1002/anie.201506994 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Bijelic, A., Pretzler, M., Molitor, C., Zekiri, F. & Rompel, A. Estructura cristalina de una tirosinasa vegetal de hojas de nuez: La importancia de los "residuos de aminoácidos que dirigen el sustrato" para la especificidad de la enzima. Angew. Chem. 127, 14889-14893. https://doi.org/10.1002/anie.201506994 (2015).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Malkin, R. & Malmstrom, BG El estado y función del cobre en los sistemas biológicos. Adv. Enzimol. Relativo Áreas Moleular Biol. 33, 177–244. https://doi.org/10.1002/9780470122785.ch4 (1970).

Artículo CAS Google Académico

Klabunde, T., Eicken, C., Sacchettini, JC & Krebs, B. Estructura cristalina de una catecol oxidasa vegetal que contiene un centro de dicobre. Nat. Estructura. Biol. 5, 1084–1090. https://doi.org/10.1038/4193 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Eicken, C., Krebs, B. & Sacchettini, JC Catecol oxidasa - Estructura y actividad. actual Opinión Estructura. Biol. 9, 677–683. https://doi.org/10.1016/S0959-440X(99)00029-9 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Malmström, BG Enzimología del oxígeno. año Rev. Bioquímica. 51, 21–59. https://doi.org/10.1146/annurev.bi.51.070182.000321 (1982).

Artículo PubMed Google Académico

Kampatsikas, I., Bijelic, A. & Rompel, A. La caracterización bioquímica y estructural de las polifenol oxidasas de tomate proporciona nuevos conocimientos sobre su especificidad de sustrato. ciencia Rep. 9, 4022. https://doi.org/10.1038/s41598-019-39687-0 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Solano, F. Melanins: Pigmentos de la piel y mucho más—Tipos, modelos estructurales, funciones biológicas y rutas de formación. Nueva J. Sci. 2014, 1–28. https://doi.org/10.1155/2014/49827 (2014).

Artículo Google Académico

Aderson, JV, Fuerst, EP, Hurkman, WJ, Vensel, WH y Morris, CF Caracterización bioquímica y genética de las polifenoloxidasas del grano de trigo (Triticum spp.). J. Ciencias de los cereales. 44, 353–367. https://doi.org/10.1016/j.jcs.2006.06.008 (2006).

Artículo CAS Google Académico

Bibhuti Bhusan Mishra, B. Polifonel oxidasas: caracterización bioquímica y molecular, distribución, función y su control. enzima Ing. 5, 1–9. https://doi.org/10.4172/2329-6674.1000141 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Tran, LT, Taylor, JS y Constabel, CP La familia de genes de polifenol oxidasa en plantas terrestres: duplicación y expansión específicas del linaje. BMC Genomics 13, 395. https://doi.org/10.1186/1471-2164-13-395 (2012).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sommer, A., N,eeman, E., Steffens, JC, Mayer, AM y Harel, E. Importación, focalización y procesamiento de una polifenol oxidasa vegetal. Fisiol vegetal. 105, 1301-1311. https://doi.org/10.1104/pp.105.4.1301 (1994).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Koussevitzky, S., Ne, E., Sommer, A., Steffens, JC y Harel, E. Purificación y propiedades de un nuevo estromal de cloroplasto. J. Biol. química 273, 27064–27069. https://doi.org/10.1074/jbc.273.42.27064 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Valero, E. & Garcia-Carmonatt, F. Cooperativa cinética inducida por pH de una polifenol oxidasa unida a tilacoides. Bioquímica J. 286, 623–626. https://doi.org/10.1042/bj2860623 (1992).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Mauracher, SG, Molitor, C., Al-Oweini, R., Kortz, U. & Rompel, A. Tirosinasa de hongo abPPO4 latente y activa cocristalizada con hexatungstotelurato (VI) en un monocristal. Acta Cryst. D Biol. cristalogr. 70, 2301–2315. https://doi.org/10.1107/S1399004714013777 (2014).

Artículo CAS Google Académico

Sugumaran, M. & Nellaiappan, K. Lysolecithin-A potente activador de profenolxidasa de la hemolinfa de la langosta, Homarus Americans. Bioquímica Biografía. Res. común 176, 1371–1376. https://doi.org/10.1016/0006-291x(91)90438-d (1991).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Tolbert, NE Activación de polifenol oxidasa de cloroplastos. Fisiol vegetal. 51, 234–244. https://doi.org/10.1104/pp.51.2.234 (1973).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gauillard, F. & Richard-Forget, F. Polifenoloxidasas de pera williams (Pyrus communis L, cv Williams): Activación, purificación y algunas propiedades. J. Ciencia. Alimentación Agrícola. 74, 49–56. https://doi.org/10.1002/(sici)1097-0010(199705)74:1%3c49::aid-jsfa769%3e3.0.co;2-k (1997).

3.0.co;2-k" data-track-action="article reference" href="https://doi.org/10.1002%2F%28sici%291097-0010%28199705%2974%3A1%3C49%3A%3Aaid-jsfa769%3E3.0.co%3B2-k" aria-label="Article reference 28" data-doi="10.1002/(sici)1097-0010(199705)74:13.0.co;2-k">Artículo CAS Google Académico

Golbeck, JH & Cammarata, KV Polifenol oxidasa tilacoidal de espinaca. Fisiol vegetal. 67, 977–984. https://doi.org/10.1104/pp.67.5.977 (1981).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kenten, RH Fenolasa latente en extractos de hojas de haba (Vicia faba L.). Biol. química https://doi.org/10.1042/bj0670300 (1957).

Artículo Google Académico

Gandia-Herrero, F., Cabanes, MJ, Garcıa-Carmona, F. & Escribano, J. Evidencia de una regulación común en la activación de una polifenol oxidasa por tripsina y dodecilsulfato de sodio. Biol. química 386, 601–607. https://doi.org/10.1515/BC.2005.070 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Martín, HJ et al. Síntesis total, asignación estereoquímica y reconocimiento enzimático enantioselectivo divergente de larreatricina. química EUR. J. 24, 15756–15760. https://doi.org/10.1002/chem.201803785 (2018).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Sánchez-Ferrer, A., Laveda, F. & García-Carmona, F. Activación dependiente del sustrato de la polifenol oxidasa latente de hoja de patata por tensioactivos aniónicos. J. Agric. Química alimentaria 41, 1583–1586. https://doi.org/10.1021/jf00034a010 (1993).

Artículo Google Académico

Derardja, A., Pretzler, M., Kampatsikas, I., Barkat, M. y Rompel, A. Purificación y caracterización de la polifenol oxidasa latente del albaricoque (Prunus armeniaca L.). J. Agric. Química alimentaria 65, 8203–8212. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.7b03210 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kampatsikas, I., Bijelic, A., Pretzler, M. y Rompel, A. Una reacción de autoescisión inducida por péptidos inicia la activación de la tirosinasa. Angew. química En t. ed. 58, 7475–7479. https://doi.org/10.1002/anie.201901332 (2019).

Artículo CAS Google Académico

Kampatsikas, I., Bijelic, A., Pretzler, M. y Rompel, A. Una reacción de autoescisión mediada por péptidos inicia la activación de la tirosinasa. Angew. Chem. 131, 7553-7557. https://doi.org/10.1002/anie.201901332 (2019).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Tindall, H. D. Sapindaceous fruits: Botany and horticulture. Hortic. Rev. (Am. Soc. Hortic. Sci.) 16, 143–196. https://doi.org/10.1002/9780470650561.ch5 (1994).

Artículo Google Académico

Zhang, X., Guo, S., Ho, C. & Bai, N. Constituyentes fitoquímicos y actividades biológicas de la fruta longan (Dimocarpus longan Lour.): Una revisión. ciencia de la comida Tararear. Bienestar 9, 95–102. https://doi.org/10.1016/j.fshw.2020.03.001 (2020).

Artículo Google Académico

Rangkadilok, N., Worasuttayangkurn, L., Bennett, RB y Satayavidad, J. Identificación y cuantificación de compuestos polifenólicos en frutos de longan (Euphoria longana Lam.). J. Agric. Química alimentaria 53, 1387–1392. https://doi.org/10.1021/jf0403484 (2005).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Él, N. et al. Aislamiento e identificación de compuestos polifenólicos en pericarpio de longan. Sep. Purfication Technol. 70, 219–224. https://doi.org/10.1016/j.seppur.2009.09.019 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Zhang, R., Khan, SA, Lin, Y., Guo, D. & Pan, X. Perfiles fenólicos y actividad antioxidante celular de la pulpa longan de 24 cultivares chinos representativos. En t. J. Comida Prop. 21, 746–759. https://doi.org/10.1080/10942912.2018.1425705 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Prasad, KN et al. Actividades antioxidantes y anticancerígenas del extracto asistido por alta presión de pericarpio de fruta longan (Dimocarpus longan Lour.) innovador ciencia de la comida emergente Tecnología 10, 413–419. https://doi.org/10.1016/j.ifset.2009.04.003 (2009).

Artículo CAS Google Académico

Chen, J. et al. Elucidación estructural y evaluación de la actividad antioxidante de compuestos fenólicos clave aislados de semillas de longan (Dimocarpus longan Lour.). Función J. Alimentos 17, 872–880. https://doi.org/10.1016/j.jff.2015.06.028 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Sudjaroen, Y. et al. Aislamiento y caracterización de elagitaninos como los principales componentes polifenólicos de las semillas de Longan (Dimocarpus longan Lour). Fitoquímica 77, 226–237. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2011.12.008 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jiang, Y., Zhang, Z., Joyce, DC & Ketsa, S. Biología poscosecha y manejo de la fruta longan (Dimocarpus longan Lour.). Poscosecha Biol. Tecnología 26, 241–252. https://doi.org/10.1016/S0925-5214(02)00047-9 (2002).

Artículo Google Académico

Jiang, Y., Joyce, D. y Lin, H. Longan (Dimocarpus longan Lour.). En Biología y tecnología poscosecha de frutas tropicales y subtropicales. https://doi.org/10.1016/B978-1-84569-735-8.50016-4 (Woodhead Publishing Limited, 2011).

Lin, HT, Chen, SJ, Chen, JQ & Hong, QZ Situación actual y avances en las tecnologías de transporte y almacenamiento poscosecha de la fruta longan. Acta Hortica. 558, 343–351. https://doi.org/10.17660/ActaHortic.2001.558.56 (2001).

Artículo Google Académico

Prasad, K., Neha, P. & Lal, MK Cultivo y técnicas de manejo poscosecha de posibles cultivos futuros 'longan' (Dimocarpus longan Lour) en la región de Asia Pacífico: una revisión. Res. Cultivo. 18, 384–392. https://doi.org/10.5958/2348-7542.2017.00067.5 (2017).

Artículo Google Académico

Chaikham, P., Apichartsrangkoon, A. y Seesuriyachan, P. Cualidades físicas y bioquímicas de los jugos de longan presurizados y pasteurizados durante el almacenamiento. Emiratos J. Food Agric. 26, 218–228. https://doi.org/10.9755/ejfa.v26i3.16576 (2014).

Artículo Google Académico

Taranto, F. et al. Polifenol oxidasas en cultivos: Aspectos bioquímicos, fisiológicos y genéticos. En t. J. Mol. ciencia 18, 377–392. https://doi.org/10.3390/ijms18020377 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Molitor, C., Mauracher, SG y Rompel, A. La aurona sintasa es una catecol oxidasa con actividad de hidroxilasa y proporciona información sobre el mecanismo de las polifenol oxidasas vegetales. proc. nacional Academia ciencia Estados Unidos 113, 1806–1815. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.03.016 (2016).

Artículo ADS CAS Google Académico

Zekiri, F. et al. Purificación y caracterización de tirosinasa de hojas de nogal (Juglans regia). Fitoquímica 101, 5–15. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2014.02.010 (2014).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Heimdal, H., Larsen, LM & Poll, L. Caracterización de polifenol oxidasa de tejidos de lechuga fotosintéticos y vasculares (Lactuca sativa). J. Agric. Química alimentaria 42, 1428–1433. https://doi.org/10.1021/jf00043a008 (1994).

Artículo CAS Google Académico

Molitor, C., Mauracher, SG & Rompel, A. Cristalización y análisis cristalográfico preliminar de aurona sintasa latente, activa y expresada recombinantemente, una polifenol oxidasa de Coreopsis grandiflora. Acta Cryst. Estructura F. Biol. común 71, 746–751. https://doi.org/10.1107/S2053230X1500754 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Fraignier, M., Marques, L., Fleuriet, A. & Macheix, J. Características bioquímicas e inmunoquímicas de polifenol oxidasas de diferentes frutos de Prunus. J. Agric. Química alimentaria 43, 2375–2380. https://doi.org/10.1021/jf00057a011 (1995).

Artículo CAS Google Académico

Robinson, H. et al. Base estructural de la modulación por transferencia de electrones en el centro púrpura Cu A. Bioquímica 38, 5677–5683. https://doi.org/10.1021/bi9901634 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Saba, MK & Moradi, S. Trastorno de pardeamiento interno de ocho cultivares de pera afectados por componentes bioactivos y actividad enzimática. Química alimentaria 205, 257–263. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2016.03.022 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Sánchez-Ferrer, A., Laveda, F. & García-Carmona, F. Purificación parcial de polifenol oxidasa soluble de patata mediante partición en un sistema acuoso de dos fases. J. Agric. Química alimentaria 41, 1219–1224. https://doi.org/10.1021/jf00032a010 (1995).

Artículo Google Académico

Reinkensmeier, A. et al. Monitoreo de la formación de aductos modulados por polifenol oxidasa de manzana de compuestos fenólicos y amino. Química alimentaria 194, 76–85. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.07.145 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Docimo, T. et al. Información sobre los mecanismos de oscurecimiento de la pulpa de la fruta en líneas genéticas de Solanum melongena con comportamiento postcorte opuesto. J. Agric. Química alimentaria 64, 4675–4685. https://doi.org/10.1021/acs.jafc.6b00662 (2016).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Miller, AR, Kelley, TJ & Mujer, CV Isoenzimas de peroxidasa anódica y actividad de polifenol oxidasa de frutos de pepino: especificidad de tejido y sustrato. Fitoquímica 29, 705–709. https://doi.org/10.1016/0031-9422(90)80005-2 (1990).

Artículo CAS Google Académico

Yue-Ming, J. Purificación y algunas propiedades de la polifenol oxidasa de la fruta longan. Química alimentaria 66, 75–79. https://doi.org/10.1016/S0308-8146(98)00242-8 (1999).

Artículo Google Académico

Sun, J. et al. Comparación de la caracterización de la polifenoloxidasa de longan (Dimocarpus longan Lour.) utilizando sustratos endógenos y exógenos. J. Agric. Química alimentaria 58, 10195–10201. https://doi.org/10.1021/jf101639d (2010).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Qilin, T., Yuling, L., Qingyou, Z., Rongfeng, S. y Zhongxiong, L. Análisis de clonación y expresión de DlPPO1 de Dimocarpus Longan Lour. Acta Bot. boreal. Occid. Pecado. 36, 1098–1104 (2016).

Google Académico

Midorikawa, T. & Inoue, K. Múltiples destinos de proteínas luminales no maduras en tilacoides. Planta. J. 76, 73–86. https://doi.org/10.1111/tpj.12273 (2013).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kampatsikas, I., Bijelic, A., Pretzler, M. & Rompel, A. Tres tirosinasas de manzana expresadas recombinantemente sugieren los aminoácidos responsables de la actividad mono-frente a la difenolasa en polifenol oxidasas vegetales. ciencia Rep. 7, 8860. https://doi.org/10.1038/s41598-017-08097-5 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Panis, F. & Rompel, A. Identificación de la posición del aminoácido que controla las diferentes actividades enzimáticas en las isoenzimas de tirosinasa de nuez (jrPPO1 y jrPPO2). ciencia Rep. 10, 10813. https://doi.org/10.1038/s41598-020-67415-6 (2020).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Panis, F., Krachler, RF, Krachler, R. & Rompel, A. Expresión, purificación y caracterización de una tirosinasa bien adaptada de turberas identificadas por análisis comunitario parcial. Reinar. ciencia Tecnología 55, 11445–11454. https://doi.org/10.1021/acs.est.1c02514 (2021).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Biundo, A. et al. Las polifenol oxidasas exhiben una actividad proteolítica promiscua. común química 3, 62. https://doi.org/10.1038/s42004-020-0305-2 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Lee, N., Lee, SH, Baek, K. & Kim, BG Expresión heteróloga de tirosinasa (MelC2) de Streptomyces avermitilis MA4680 en E. coli y su aplicación para la ortohidroxilación de resveratrol para producir piceatannol. aplicación Microbiol. Biotecnología. 99, 7915–7924. https://doi.org/10.1007/s00253-015-6691-1 (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Moe, LL, Maekawa, S. y Kawamura-Konishi, Y. El dominio de procesamiento C-terminal de la proenzima de la tirosinasa de Pholiota nameko es responsable del plegamiento del dominio catalítico N-terminal. aplicación Microbiol. Biotecnología. 99, 5499–5510. https://doi.org/10.1007/s00253-015-6597-y (2015).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Li, Y. et al. Un enfoque para producir de forma recombinante polifenol oxidasa de uva madura. Biochimie 165, 40–47. https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.07.002 (2019).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Hanna, PM, Tamilarasan, R. & McMillin, DR Cu(I) análisis de proteínas de cobre azul. Bioquímica J. 256, 1001–1004. https://doi.org/10.1042/bj2561001 (1988).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Meija, J. et al. Composiciones isotópicas de los elementos 2013 (Informe Técnico IUPAC). aplicación pura química 88, 293–306. https://doi.org/10.1515/pac-2015-0503 (2016).

Artículo CAS Google Académico

Ericsson, UB, Hallberg, BM, DeTitta, GT, Dekker, N. y Nordlund, P. Optimización de la estabilidad de alto rendimiento basada en termofluor de proteínas para estudios estructurales. Anal. Bioquímica 357, 289–298. https://doi.org/10.1016/j.ab.2006.07.027 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Marques, L., Fleuriet, A. & Macheix, J. Caracterización de múltiples formas de polifenoloxidasa de la manzana. Fisiol vegetal. Bioquímica 33, 193–200 (1995).

CAS Google Académico

Mari, S., Marques, L., Breton, F., Karamanos, Y. & Macheix, J. Despliegue y replegamiento de polifenol oxidasa de manzana activa. Fitoquímica 49, 1213–1217. https://doi.org/10.1016/s0031-9422(98)00142-3' (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Moore, BM & Flurkey, WH Activación de dodecilsulfato de sodio de una polifenoloxidasa vegetal. Efecto del dodecilsulfato de sodio sobre las características enzimáticas y físicas de la polifenoloxidasa de haba purificada. J. Biol. química 265, 4982–4988. https://doi.org/10.1016/S0021-9258(19)34072-4 (1990).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Robb, DA, Mapson, LW y Swain, T. Activación de la tirosinasa latente de haba. Naturaleza 201, 503–504. https://doi.org/10.1038/201503b0 (1964).

Artículo ADS CAS Google Académico

Sánchez-Ferrer, A., Villalba, J. & García-Carmona, F. Triton X-114 como herramienta para purificar la polifenol oxidasa de espinaca. Fitoquímica 28, 1321–1325. https://doi.org/10.1016/S0031-9422(00)97738-0 (1989).

Artículo Google Académico

Espín, JC & Wichers, HJ Activación de una isoforma de tirosinasa de hongo (Agaricus bisporus) latente por dodecilsulfato de sodio (SDS). Propiedades cinéticas de la isoforma activada por SDS. J. Agric. Química alimentaria 47, 3518–3525. https://doi.org/10.1021/jf981275p (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Escribano, J., Cabanes, J., Chazarra, S. & García-Carmona, F. Caracterización de la actividad monofenolasa del polifenol de remolacha de mesa. Oxidasa Determinación de parámetros cinéticos en el par tiramina/dopamina. J. Agric. Química alimentaria 45, 4209–4214. https://doi.org/10.1021/jf970384l (1997).

Artículo CAS Google Académico

Laveda, F., Núñez-Delicado, E., García-Carmona, F. & Sánchez-Ferrer, A. Activación reversible de dodecil sulfato de sodio de polifenol oxidasa latente de melocotón por ciclodextrinas. Arco. Bioquímica Biografía. 379, 1–6. https://doi.org/10.1006/abbi.2000.1838 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Robinson, S., Loveys, B. & Chacko, E. Enzimas polifenol oxidasa en la savia y la piel de la fruta del mango. Función Biol. vegetal 20, 99. https://doi.org/10.1071/PP9930099 (1993).

Artículo CAS Google Académico

Leufken, CM, Moerschbacher, BM & Dirks-Hofmeister, ME Dandelion PPO-1/PPO-2 domain-swaps: El dominio C-terminal modula el pH óptimo y el enlazador afecta la activación y la estabilidad mediadas por SDS. bioquimica Biografía. Acta - Proteómica de proteínas 1854, 178–186. https://doi.org/10.1016/j.bbapap.2014.11.007 (2015).

Artículo CAS Google Académico

Yoruk, R. & Marshall, MR Propiedades fisicoquímicas y función de la polifenol oxidasa vegetal: una revisión. J. Bioquímica alimentaria. 27, 361–422. https://doi.org/10.1111/j.1745-4514.2003.tb00289.x (2003).

Artículo CAS Google Académico

Ito, M. & Oda, K. Una tirosinasa resistente a disolventes orgánicos de Streptomyces sp. REN-21: Purificación y caracterización. Biosci. Biotecnología. Bioquímica 64, 261–267. https://doi.org/10.1271/bbb.64.261 (2000).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Mishra, BB, Gautam, S. & Sharma, A. Purificación y caracterización de polifenol oxidasa (PPO) de berenjena (Solanum melongena). Química alimentaria 134, 1855–1861. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2012.03.098 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rompel, A. et al. Purificación y estudios espectroscópicos sobre catecol oxidasas de Lycopus europaeus y Populus nigra: evidencia de un centro de cobre dinuclear de tipo 3 y similitudes espectroscópicas con tirosinasa y hemocianina. J. Biol. Inorg. química 4, 56–63. https://doi.org/10.1007/s007750050289 (1999).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Rompel, A., Büldt-Karentzopoulos, K., Molitor, C. & Krebs, B. Purificación y estudios espectroscópicos sobre la catecol oxidasa del toronjil (Melissa officinalis). Fitoquímica 81, 19–23. https://doi.org/10.1016/j.phytochem.2012.05.022 (2012).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Eicken, C., Zippel, F., Büldt-Karentzopoulos, K. & Krebs, B. Caracterización bioquímica y espectroscópica de la catecol oxidasa de batatas (Ipomoea batatas) que contiene un centro dicopper tipo 3. FEBS Lett. 436, 293–299. https://doi.org/10.1016/s0014-5793(98)01113-2 (1998).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Kampatsikas, I., Pretzler, M. & Rompel, A. Identificación de residuos de aminoácidos responsables de la activación de CH en enzimas de cobre tipo III mediante la generación de actividad de tirosinasa en una catecol oxidasa. Angew. química En t. ed. 59, 20940–20945. https://doi.org/10.1002/anie.202008859 (2020).

Artículo CAS Google Académico

Kampatsikas, I., Pretzler, M. & Rompel, A. La generación de actividad tirosinasa en una catecol oxidasa permite la identificación de los residuos de aminoácidos responsables de la activación de CH en enzimas de cobre tipo III. Angew. Chem. 132, 21126-21131. https://doi.org/10.1002/anie.202008859 (2020).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Trott, O. & Olson, AJ Novedades y actualización de software AutoDock Vina: mejora de la velocidad y la precisión del acoplamiento con una nueva función de puntuación, optimización eficiente y subprocesamiento múltiple. J. Cómputo. química 31, 455–461. https://doi.org/10.1002/jcc.21334 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kaintz , C. , Mayer , RL , Jirsa , F. , Halbwirth , H. & Rompel , A. Mutagénesis dirigida al sitio alrededor del sitio CuA de una polifenol oxidasa de Coreopsis grandiflora (cgAUS1). FEBS Lett. Rev. 589 , 789–797. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2015.02.009 (2015).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gambino, G., Perrone, I. & Gribaudo, I. Un método rápido y eficaz para la extracción de ARN de diferentes tejidos de vid y otras plantas leñosas resumen. Fitoquímica. Anal. 525, 520–525. https://doi.org/10.1002/pca.1078 (2008).

Artículo CAS Google Académico

Swinehart, DF La ley de Beer-Lambert. J. Chem. Educ. 39, 333–335. https://doi.org/10.1021/ed039p333 (1962).

Artículo CAS Google Académico

Gasteiger, E. et al. Herramientas de identificación y análisis de proteínas en el servidor ExPASy. En The Proteomics Protocols Handbook (ed. Walker, J.) (Humana Press, 2005).

Google Académico

Laemmli, Reino Unido Escisión de proteínas estructurales durante el ensamblaje de la cabeza del bacteriófago T4. Naturaleza 227, 680–685. https://doi.org/10.1038/227680a0 (1979).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Marquardt, DW Un algoritmo para la estimación por mínimos cuadrados de parámetros no lineales. J. Soc. Aplicación ind. Matemáticas. 11, 431–441. https://doi.org/10.1137/0111030 (1963).

Artículo MathSciNet MATEMÁTICAS Google Académico

Hanes, CS Estudios sobre amilasas vegetales. Bioquímica J. 26, 1406–1421. https://doi.org/10.1042/bj0261406 (1932).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Eickman, NC, Himmelwright, RS y Solomon, EI Estructura geométrica y electrónica de la oxihemocianina: correlaciones espectrales y químicas con los sitios activos met apo, half met, met y dímero. proc. nacional Academia ciencia EE. UU. 76, 2094–2098. https://doi.org/10.1073/pnas.76.5.2094 (1979).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arnold, K., Bordoli, L., Kopp, J. & Schwede, T. El espacio de trabajo SWISS-MODEL: un entorno basado en la web para el modelado de homología de estructuras de proteínas. Bioinformática 22, 195–201. https://doi.org/10.1093/bioinformatics/bti770 (2006).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Bordoli, L. et al. Modelado de homología de estructuras de proteínas utilizando el espacio de trabajo SWISS-MODEL. Nat. Protocolo 4, 1–13. https://doi.org/10.1038/nprot.2008.197 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Altschul, SF, Gish, W., Miller, W., Myers, EW y Lipman, DJ Herramienta básica de búsqueda de alineación local. J. Mol. Biol. 215, 403–410. https://doi.org/10.1016/S0022-2836(05)80360-2 (1990).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Remmert, M., Biegert, A., Hauser, A. & Söding, J. HHblits: Búsqueda de secuencias de proteínas iterativas ultrarrápidas por alineación HMM-HMM. Nat. Métodos 9, 173–175. https://doi.org/10.1038/nmeth.1818 (2012).

Artículo CAS Google Académico

El sistema de gráficos moleculares PyMOL, versión 2.0 Schrödinger, LLC.

Kim, S. et al. PubChem en 2021: nuevo contenido de datos e interfaces web mejoradas. Ácidos Nucleicos Res. 49, D1388–D1395. https://doi.org/10.1093/nar/gkaa971 (2021).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Allouche, A. Noticias y actualizaciones de software gabedit: una interfaz gráfica de usuario para software de química computacional. J. Cómputo. química 32, 174–182. https://doi.org/10.1002/jcc.21600 (2012).

Artículo CAS Google Académico

Wallace, AC, Laskowski, RA & Thornton, JM LIGPLOT: Un programa para generar diagramas esquemáticos de interacciones proteína-ligando. Ing. Proteínas 8, 127–134. https://doi.org/10.1093/protein/8.2.127 (1995).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Laskowski, RA & Swindells, MB LigPlot+: diagramas de interacción de proteínas y ligandos múltiples para el descubrimiento de fármacos. J. Chem. información Modelo. 51, 2778–2786. https://doi.org/10.1021/ci200227u (2011).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Descargar referencias

La investigación fue financiada por el Austria Science Fund (FWF): P32326 (AR). LR agradece enormemente a la Österreichische Austauschdienst-Gesellschaft mit beschränkter Haftung (OeAD-GmbH) por las becas Ernst-Mach Grant (MPC-2020-00926) y ASEA-UNINET (ICM-2019-15123) y también la Skill Development Grant de King Mongkut's Universidad de Tecnología, Thonburi (KMUTT) por su apoyo financiero. LR, MP, IK y AR reconocen Mag. Anna Fabisikova por su gran apoyo con los experimentos ESI-QTOF-MS. https://www.bpc.univie.ac.at/.

Facultad de Química, Instituto de Química Biofísica, Universidad de Viena, Josef-Holaubek-Platz 2, 1090, Viena, Austria

Leela Ruckthong, Matthias Pretzler, Ioannis Kampatsikas y Annette Rompel

Facultad de Ciencias, Departamento de Química, Universidad Tecnológica del Rey Mongkut Thonburi (KMUTT), Thung Kru, Bangkok, 10140, Tailandia

Leela Ruckthong

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

También puede buscar este autor en PubMed Google Scholar

LR Conceptualización: Apoyo; Investigación: Plomo; Curación de datos: Apoyo; Redacción - Borrador original: Plomo; Redacción - Revisión y edición: Plomo. MP Conceptualización: Soporte; Investigación: Apoyo; Curación de datos: Plomo; Redacción - Borrador original: Apoyo; Redacción - Revisión y Edición: Apoyo. Conceptualización IK: Plomo; Investigación: Apoyo; Curación de datos: Apoyo; Supervisión: Apoyo; Redacción - Borrador original: Apoyo; Redacción - Revisión y Edición: Apoyo. AR Conceptualización: Apoyo; Adquisición de fondos: Plomo; Administración del proyecto: Líder; Supervisión: Líder; Redacción - Borrador original: Apoyo; Redacción - Revisión y Edición: Apoyo. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Annette Rompel.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Ruckthong, L., Pretzler, M., Kampatsikas, I. et al. La caracterización bioquímica de la polifenol oxidasa de Dimocarpus longan proporciona información sobre su eficiencia catalítica. Informe científico 12, 20322 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-20616-7

Descargar cita

Recibido: 12 julio 2022

Aceptado: 15 de septiembre de 2022

Publicado: 25 noviembre 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-022-20616-7

Cualquier persona con la que compartas el siguiente enlace podrá leer este contenido:

Lo sentimos, un enlace para compartir no está disponible actualmente para este artículo.

Proporcionado por la iniciativa de intercambio de contenido Springer Nature SharedIt

Al enviar un comentario, acepta cumplir con nuestros Términos y Pautas de la comunidad. Si encuentra algo abusivo o que no cumple con nuestros términos o pautas, márquelo como inapropiado.