Evaluación de ciclodextrinas polianiónicas como andamios de unión de alta afinidad para fentanilo

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 2680 (2023) Citar este artículo

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Se ha demostrado previamente que las ciclodextrinas (CD) muestran afinidades de unión de equilibrio moderadas (Ka ~ 100–200 M-1) para el analgésico opioide sintético fentanilo. En este trabajo, describimos la síntesis de nuevos CD que poseen restos extendidos de tioalquilcarboxilo o tioalquilhidroxilo y evaluamos su afinidad de unión hacia el clorhidrato de fentanilo. La CD óptima estudiada muestra una notable afinidad por el opioide de Ka = 66 500 M−1, el mayor valor informado hasta la fecha para un complejo de inclusión de este tipo. Los experimentos de resonancia magnética nuclear (RMN) 1H unidimensional, así como los experimentos de espectroscopia Overhauser de marco rotacional (2D-ROESY) respaldados por simulaciones de dinámica molecular (MD) sugieren un comportamiento de unión inesperado, con fentanilo capaz de unirse al interior del CD en una de dos orientaciones distintas . Las energías de unión derivadas del trabajo de las simulaciones de MD se correlacionan fuertemente con las afinidades derivadas de la RMN, lo que destaca su utilidad como herramienta predictiva para la optimización de candidatos de CD. El desempeño de estas moléculas anfitrionas presagia su utilidad como plataformas para contramedidas médicas para la exposición a opioides, como biosensores y en otras aplicaciones de la ciencia forense.

Los opioides sintéticos a base de fentanilo han encontrado numerosas aplicaciones en el campo médico como anestésicos efectivos y se consideran más seguros que la morfina durante los procedimientos perioperatorios1,2,3. Su potente actividad se deriva de su capacidad para unirse a varios receptores nociceptivos en el sistema nervioso, siendo uno de sus principales objetivos el receptor opioide μ4,5. Al igual que la morfina y otros alcaloides diseñados para combatir el dolor, los fentanilos lamentablemente presentan un alto riesgo de dependencia y adicción debido a su efecto eufórico sobre el sistema nervioso central (SNC). Desafortunadamente, su uso ilícito ha llevado a una alta tasa de muerte relacionada con sobredosis en lo que se reconoce en gran medida como una epidemia de fentanilo6,7,8,9.

El compuesto insignia de esta clase de opioides es el fentanilo, que tiene una potencia ~ 100 veces superior a la de la morfina (fig. 1a)10,11. Aunque tanto el fentanilo como la morfina muestran un potencial tóxico si no se administran con cuidado a un individuo, el fentanilo suele ser motivo de mayor preocupación debido a que su producción es mucho más sencilla. Además, dada la facilidad de síntesis del opioide, la producción de nuevos análogos caracterizados por mayores perfiles analgésicos no es difícil12,13,14. Además de sus usos médicos, algunos de estos opioides, como el acetilfentanilo, se han relacionado con casos de sobredosis mortales por uso recreativo, mientras que el carfentanilo y el remifentanilo se han relacionado con su uso como agentes de guerra química (Fig. 1b)15,16. Dado que los opioides a base de fentanilo han aumentado tanto en potencia como en uso durante las últimas décadas17, una importante investigación se ha centrado en el desarrollo de métodos analíticos eficientes para su detección9,16,18 y en antídotos eficaces para contrarrestar sus efectos fisiológicos19,20. Los antídotos como la naloxona y la naltrexona (Fig. 1c) se han convertido en los principales métodos de tratamiento de sobredosis; sin embargo, aún carecen de la capacidad de proporcionar una protección prolongada contra estos opioides sintéticos. Esta efectividad reducida se debe a la larga vida media de circulación del opioide en la sangre (t1/2 ~ 7–9 h), mientras que las vidas medias de circulación de la naloxona y la naltrexona son significativamente más cortas en t1/2 ~ 2 h y t1/2 ~ 4 h, respectivamente19. Para abordar este problema, los grupos de investigación han lanzado programas destinados a desarrollar candidatos a contramedidas médicas (MCM, por sus siglas en inglés) que brinden protección a más largo plazo contra los fentanilos, particularmente cuando se retira a la persona afectada de la intervención médica de emergencia. Algunos de estos esfuerzos han girado en torno a la noción de emplear moléculas huésped que podrían, en principio, capturar opioides sintéticos en su interior y, dependiendo de su afinidad de unión hacia ellos, podrían ser andamios efectivos para ser utilizados como MCM. Una clase de sistemas anfitriones que ha sido estudiada en detalle por el grupo de Isaacs en la Universidad de Maryland para este propósito y también para la reversión de la anestesia han sido los urils de cucurbitáceas21,22. Su trabajo, que comenzó con estos anfitriones de base cíclica, condujo finalmente al descubrimiento de un poderoso anfitrión para la metanfetamina23 y el fentanilo24, curiosamente de naturaleza acíclica, lo que le proporcionó suficiente flexibilidad para modificar su captura efectiva del opioide. Otro conjunto de huéspedes similares pero basados en un esqueleto de carbohidratos son las ciclodextrinas, que desafortunadamente han sido evaluadas marginalmente para estas aplicaciones25.

(a) Estructuras químicas de fentanilo y morfina, la potencia del opioide en relación con la morfina (~ 100x) se proporciona junto con su vida media de circulación sistémica (t1/2); (b) estructuras de dos de los antídotos más comunes usados para tratar el envenenamiento por fentanilo, naloxona y naltrexona junto con sus vidas medias de circulación sistémica; (c) estructuras de análogos de fentanilo encontrados en varios casos de sobredosis en los EE. UU. (acetilfentanilo), así como otros utilizados como agentes incapacitantes (carfentanilo y remifentanilo), se proporcionan sus potencias en relación con la morfina; (d) estructura de β-ciclodextrina que muestra las siete unidades de glucosa unidas en forma de α1,4 dando lugar a una estructura cónica (trum) abierta en ambos extremos con un interior hidrofóbico y un exterior hidrofílico; (e) representación de un hipotético complejo de inclusión formado entre β-CD y fentanilo.

Las ciclodextrinas (CD), motivos de oligosacáridos cíclicos compuestos por unidades de glucosilo unidas entre sí a través de enlaces glucosídicos α1,4 (Fig. 1d), han llamado la atención recientemente como posibles candidatos a contramedidas médicas. La disposición cíclica de estas unidades de glucosa da lugar a un andamiaje macromolecular que se asemeja a un frustrum con un borde inferior más grande que su parte superior (Fig. 1e). Esta disposición proporciona a los CD un exterior hidrofílico y un interior hidrofóbico capaz de acomodar moléculas orgánicas, una propiedad física clave de estos compuestos26,27. Esta capacidad de servir como huésped molecular ha convertido a los CD en plataformas versátiles para su uso en la industria28, la medicina29 y la ciencia de los materiales30. Naturalmente, cuanto mayor sea el número de unidades de glucosa, mayor será la cavidad del tronco y, por lo tanto, su capacidad para albergar huéspedes más grandes en su interior. Un manejo experimental crucial y útil que tienen los investigadores es que los complejos huésped:huésped, también llamados complejos de inclusión, pueden estudiarse mediante varios métodos espectroscópicos que incluyen UV-Vis31, infrarrojos32 y espectroscopias de resonancia magnética nuclear33, así como métodos espectrométricos como la cromatografía líquida. espectrometría de masas (LC-MS)34. Nuestro trabajo anterior se basó principalmente en la RMN para estudiar los complejos entre las CD nativas y el fentanilo y otras toxinas (Fig. 1e)25,35. Haciendo uso de extensos estudios de titulación de RMN junto con espectroscopía Overhauser de marco rotacional bidimensional (2D-ROESY), se pueden determinar las afinidades de unión de CD:fentanilo, así como la estructura del complejo. Aunque se demostró previamente que se forman complejos de inclusión entre las CD nativas y el fentanilo, las afinidades de unión fueron bajas y no significativamente fuertes para justificar su uso como un potencial aglutinante de fentanilo. En este informe, presentamos la síntesis de andamios de CD más complejos observados para formar fuertes complejos de inclusión con fentanilo. Nuestros esfuerzos han aprovechado las titulaciones de RMN para determinar la fuerza de unión entre el candidato líder actual, llamado "subetadex" (SBX), y el fentanilo. Además, se obtuvo información importante sobre la estructura del complejo SBX:fentanilo mediante experimentos de RMN 2D-ROESY. Se encontró que estos datos experimentales estaban en buen acuerdo con los cálculos de modelado computacional que también se usaron para explorar candidatos adicionales de andamios de CD con afinidades mejoradas de fentanilo.

Este trabajo se centra en la exploración de andamios de CD más complejos alentados por nuestros estudios iniciales sobre la captura de fentanilo con CD nativos y simplemente sustituidos25, así como el conocimiento de otros andamios de CD que han encontrado con éxito aplicaciones biomédicas importantes por su capacidad para unirse y efectivamente neutralizar objetivos específicos. Uno de estos CD es Sugammadex (SGX), que es un fármaco aprobado por la FDA para el tratamiento de pacientes que experimentan efectos anestésicos posoperatorios prolongados del bromuro de rocuronio (RocBr)36,37,38,39,40. SGX fue descubierto en 2001 en Organon Laboratories36 y mostró una fuerte afinidad por RocBr mientras minimizaba los efectos secundarios potencialmente tóxicos. Después de años de evaluación, SGX fue aprobado por la FDA en 2015 y ahora se ha convertido en un tratamiento común para aliviar los síntomas anestésicos asociados con el uso de RocBr en el entorno quirúrgico debido a su naturaleza no tóxica y la fuerte asociación compleja constante para el anestésico (Ka ~ 750,000 M-1) determinado por experimentos de titulación de resonancia magnética nuclear (RMN)41. Al igual que SGX, el presente trabajo buscó identificar un candidato de CD con un perfil no tóxico y que mostrara una alta afinidad por el fentanilo y los opioides sintéticos relacionados.

Estructuralmente, SGX se basa en un núcleo γ-CD que tiene su borde superior modificado químicamente con cadenas de ácido 3-mercaptopropanoico. Estos restos adicionales sirven para alargar el interior hidrofóbico del CD nativo. Según nuestros estudios previos25, se descubrió que la cavidad de γ-CD era demasiado grande para acomodar fentanilo en su interior, y los cálculos de MD mostraron que el opioide pasó la mayor parte del tiempo de simulación sin unirse. Por esta razón, los esfuerzos iniciales de detección se centraron en andamios basados en β-ciclodextrina-(β-CD), ya que su interior acomodaba mejor al opioide. Nuestros datos anteriores de RMN y simulaciones de MD mostraron que los fentanilos se unen a la β-CD nativa en el anillo de fentanilo de amida de fentanilo, aunque las afinidades de unión observadas fueron bastante bajas (Ka < 250 M-1). Se encontró que las estructuras de estos complejos determinadas a partir de estos datos dejan la mayor parte de la molécula de fentanilo fuera de la CD, con su grupo fenetilo mayormente solvatado por agua. Estas interacciones entálpicamente desfavorables explican en parte los complejos débiles observados. Para mejorar la complejación, se concibieron CD que encierran una fracción mucho mayor del opioide, lo que proporciona interacciones más favorables, principalmente de van der Waals y Coulombic34. La biblioteca examinada en este trabajo actual se basa en el huésped β-CD con ligeras variaciones en una modificación común, a saber, el reemplazo de todos los grupos hidroxilo de posición 6 con tioalquilcarboxilatos o tioalquilalcoholes de cadena lineal (Fig. 2).

Esquema estructural básico de una βCD con su resto C6-hidroxilo en el borde superior reemplazado por un grupo R generalizado. Hay dos tipos de restos investigados en este trabajo, los aniónicos que comprenden CD con los grupos 2-mercaptoacetilo (SBX-1, 1), 3-mercaptopropionoilo (SBX, 2) y 4-mercaptobutanoilo (SBX + 1, 3). El segundo tipo de fracciones implica las que llevan fracciones neutras en el borde superior con 2-mercaptoetanol (SBN-1, 4), 3-mercaptopropanol (SBN, 5) y 4-mercaptobutanol (SBN + 1, 6). Además de estos objetivos basados en βCD, SAX (Sualphadex, 7) y SGX (Sugammadex, 8) también se sintetizaron y evaluaron por separado; sin embargo, ninguno mostró una unión significativa al fentanilo.

Las afinidades de unión en equilibrio entre el panel de CD y el fentanilo·HCl se determinaron utilizando experimentos de titulación de RMN 1H. Para derivar la constante de unión más precisa, los experimentos se diseñaron de modo que la concentración de CD [H]T (en unidades de M) satisficiera la desigualdad [H]TK < 1 siempre que fuera posible. Los estudios iniciales requerían estimaciones aproximadas de K ya que eran desconocidas a priori. Los desplazamientos químicos de RMN de 1H de los protones indicadores en CD (H3 y H5) se controlaron mientras se añadía gradualmente la solución valorante de fentanilo. Los datos representativos de estas titulaciones se encuentran en la Fig. 2 de Información de apoyo. El ajuste de mínimos cuadrados no lineales se realizó usando expresiones matemáticas apropiadas para los datos de unión obtenidos. Este ajuste se realizó en todas las curvas de titulación de protones informadores y produjo simultáneamente una afinidad de unión global para cada par de CD:fentanilo25. Los resultados de este procedimiento de ajuste se dan en la primera columna de datos de la Tabla 1.

En la mayoría de los casos, los datos de RMN podrían ajustarse a un modelo que describa la unión como un sistema simple 1:1. Sin embargo, los datos del diagrama de trabajo de RMN, que se utilizan para justificar el uso de dicho modelo, mostraron una clara desviación de un modelo vinculante 1: 1 para SBX y SBX + 1, con máximos ligeramente fuera de la fracción esperada, r = 0.5 (ver Fig. 1 en Información de apoyo). Estos datos instaron a la consideración de un modelo 1:1 de dos estados que pudiera describir tanto el comportamiento del diagrama de Job observado como el de las titulaciones mismas. Además, los datos de titulación mostraron un comportamiento claramente no monótono para múltiples protones indicadores (consulte la Fig. 2 en la Información de apoyo).

La Figura 3 compara las afinidades de unión determinadas por RMN para complejos de CD:fentanilo 1:1 con energías de unión de simulación MD (valores proporcionados en las columnas más a la derecha de la Tabla 1). Los datos para α-CD y β-CD de nuestro trabajo anterior se incluyen para completar. Para los aniónicos SBX-1, SBX y SBX + 1 (2–4), los resultados de RMN muestran una fuerte correlación con el comportamiento predicho por las simulaciones MD. Es decir, la afinidad de unión aumenta con la energía de unión probablemente debido a interacciones mejoradas de van der Waals proporcionadas por la naturaleza hidrofóbica de la cadena principal alargada de los tioalquilcarboxilatos aniónicos. Esta afirmación está respaldada por trabajo computacional adicional que muestra una meseta en la afinidad por los CD que muestran brazos aniónicos más extendidos (p. ej., SBX + 2 y SBX + 3 (no sintetizados)). Esta observación indica que hay pocas ventajas para los brazos de tiocarboxilato de más de cuatro carbonos (es decir, SBX + 1), que son suficientes para encerrar completamente la molécula de fentanilo (es decir, complementariedad de tamaño óptimo). Sin embargo, nos abstenemos de sobreinterpretar cualquier comparación directa de RMN/MD, ya que las cantidades derivadas de MD descuidan el efecto de la entropía conformacional en la termodinámica general. En otras palabras, una energía libre no se calcula estrictamente. En su lugar, se calcula una energía promedio, denominada < U + W > como se describió anteriormente41.

Afinidades de unión por RMN (modelo simple 1:1) versus energías entálpicas determinadas a partir de la simulación para el confórmero dominante de fentanilo unido a los huéspedes 1–6 y a la α- y β-ciclodextrina31. Tenga en cuenta que la afinidad informada aquí para SBX + 1 es la conformación dominante del modelo 1: 1 de dos estados más complejo (67 mM-1) Andamios de CD neutrales dados como círculos; todos los demás como cuadrados rellenos. La línea continua es un ajuste lineal a los puntos de datos llenos considerando las incertidumbres de medición. La línea discontinua tiene pendiente RT (0,602 kcal mol-1 a 303 K).

Para los CD neutrales (es decir, SBN-1, SBN y SBN + 1), las simulaciones MD iniciales predijeron una afinidad de unión mejorada con una longitud de brazo creciente de manera similar a sus contrapartes aniónicas. Los datos de RMN, sin embargo, muestran una disminución dramática en la afinidad de unión, que en realidad empeora con el aumento de la longitud del brazo (ver Tabla 1, Fig. 1). Los datos estructurales de RMN de los experimentos ROESY muestran correlaciones claras entre los protones H3 y H5 del interior de la CD y los que se encuentran a lo largo de sus brazos tioalquilhidroxilo (ver Información de apoyo). Simulaciones MD adicionales de estos CD neutrales solos en solución respaldaron este comportamiento. En última instancia, la fuerza impulsora hidrofóbica que existe para que los brazos de tioalquilhidroxilo hidrofóbicos se orienten dentro de la cavidad del CD parece impedir que el fentanilo se una a través de un efecto competitivo de autounión con brazos más largos que se unen mejor dentro de la cavidad. Luego, inferimos que los brazos de tiocarboxilato de los CD cargados no solo brindan la solubilidad acuosa necesaria del CD, sino que, posiblemente, lo que es más importante, probablemente mantengan el SBX aniónico lo suficientemente abierto como para que el fentanilo se una mediante repulsión electrostática. Tenga en cuenta que MD sugiere que hay poca interacción entre los extremos carboxilato y la molécula de fentanilo, ya que los grupos cargados se orientan hacia su entorno acuoso.

Los resultados presentados hasta ahora representan una vista simplificada de los detalles estructurales de los complejos SBX:fentanilo. Como se mencionó anteriormente, los datos de RMN en forma de diagramas de trabajo (consulte la Fig. 1 en Información de apoyo), que se utilizan para determinar las estequiometrías huésped:huésped42,43,44, revelaron un comportamiento de enlace más complejo que inicialmente se pensó que se originaba en una relación 1:2. o complejo 2:1 anfitrión:invitado. Sin embargo, las simulaciones de MD mostraron que la CD no podía acomodar una segunda molécula de fentanilo. Sin embargo, simulaciones adicionales mostraron que los CD cargados podían acomodar fentanilo en dos conformaciones distintas (Fig. 4). En el caso de SBX-1, la orientación con la mitad de amida del fentanilo apuntando "hacia abajo" hacia los extremos de la cadena aniónica se favorece ligeramente energéticamente sobre el fentanilo en la dirección opuesta (ver Fig. 4a). Para SBX + 1, se prefiere la configuración inversa con la mitad de la amida apuntando "hacia arriba" hacia el borde secundario no modificado del CD (ver Fig. 4b). Se observó que ambas conformaciones eran favorables, con diferencias de energía relativamente pequeñas entre ellas (0.8–5.8 kcal mol-1 dependiendo de la molécula huésped, Fig. 4c). Para SBX, las dos conformaciones son igualmente favorables.

Resultados MD para el complejo host:guest con dos orientaciones: (a) fentanilo (átomos de carbono en cian) alineados "abajo" con la mitad de amida cerca del borde primario de SBX (átomos de carbono en verde), (b) fentanilo en alternancia, "arriba " posición dentro de SBX, c) energías de enlace para los tres complejos SBX.

Los hallazgos de MD son consistentes con los experimentos de RMN de espectroscopía de efecto Overhauser nuclear de marco giratorio (ROESY). La figura 5 proporciona el espectro ROESY bidimensional de una mezcla de SBX + 1:fentanilo (ver también la figura 3 en Información de apoyo). De particular importancia es la ausencia total de correlaciones entre los protones de metileno en el brazo CD aniónico y los protones aromáticos en el anillo de fenilo unido a nitrógeno de amida. Más bien, solo se encontraron correlaciones entre estos metilenos y los protones fenetil-aromáticos del fentanilo. Este hallazgo indica que la mayoría del fentanilo se une en la orientación "hacia arriba", de acuerdo con los resultados de MD. Los datos de ROESY para una mezcla de SBX-1:fentanilo muestran una concordancia similar a los datos de MD, es decir, los protones de fenilo de amida se correlacionan con los protones de CD interiores cerca de su borde secundario no modificado. Estos picos proporcionan una clara evidencia de una preferencia del complejo para adoptar la orientación "hacia abajo". Para los tres CD cargados, los datos del diagrama de trabajo (consulte los datos seleccionados en la Fig. 1 de la información de respaldo) muestran evidencia de un sistema de enlace de dos estados, independientemente de la falta de correlaciones claras en los espectros ROESY. Los diagramas de trabajo son mucho más sensibles para detectar este tipo de fenómenos, ya que cubren un rango de concentración relativa sustancialmente más amplio (es decir, relación [H]0/[G]0) que los experimentos de titulación.

Espectro ROESY parcial de SBX + complejo 1:fentanyl HCl. Las correlaciones entre los protones aromáticos de fentanilo del anillo de fenetilo y los metilenos SBX + 1 están resaltadas por el cuadro discontinuo. El espectro completo se proporciona en la Fig. 3 de Información de apoyo.

La evidencia de una coexistencia en equilibrio de las dos conformaciones implica que el modelo de unión 1:1 invocado anteriormente no es estrictamente apropiado para la extracción de afinidades de unión en equilibrio. Por lo tanto, desarrollamos un modelo de ajuste que considera explícitamente ambas orientaciones en los datos de titulación por desplazamiento químico. Los detalles de este modelo "autocompetitivo" se dan en Información de apoyo. Los resultados del ajuste a dicho modelo arrojaron dos constantes vinculantes de equilibrio. Para SBX:fentanilo, se observó que el mayor de los dos valores de Ka era estadísticamente similar al derivado del modelo 1:1. También se extraen constantes de unión secundarias, indicativas del complejo más débil, pero fue posible solo con datos de titulación asignar sin ambigüedades afinidades a conformaciones particulares debido a que su población relativa asociada es tan baja. Sin embargo, la aparente concordancia de los datos de RMN ROESY con los resultados de MD parece sugerir que las conformaciones dominantes establecidas a partir de los datos de RMN son aquellas con las energías calculadas más altas (es decir, las más entálpicamente favorables) como se muestra en la Fig. 3. Sin embargo, los parámetros de ajuste de este ajuste más relevante físicamente son mucho menos robustos que los obtenidos del modelo 1:1 debido al número y la alta correlación entre los parámetros de ajuste. Por esta razón, trazamos las constantes vinculantes obtenidas para el modelo 1: 1 más robusto en la Fig. 1 (con SBX + 1 como excepción, ya que los datos no podían ajustarse razonablemente bien con el modelo simple).

Los reactivos y disolventes se compraron y utilizaron tal como se recibieron. El 3-mercaptopropionato de metilo, el carbonato de cesio y el 2-mercaptoetano-1-ol se adquirieron de Alfa Aesar (Ward Hill, MA). El tioglicolato de metilo se adquirió de Pfaltz and Bauer, Inc. (Waterbury, CT). El 4-sulfanilbutanoato de metilo se adquirió de Enamine Ltd. (Kiev, Ucrania). La N-metil-2-pirrolidona se adquirió de Applied Biosystems, Thermo Fisher (Grand Island, NY). El 4-mercaptobutan-1-ol y el 3-mercaptopropan-1-ol se sintetizaron como se describió anteriormente45,46, se purificaron mediante cromatografía en columna ultrarrápida en cartuchos de gel de sílice con un sistema de purificación Biotage Isolera y se evaluó su pureza mediante 1H NMR y GC-MS47, 48,49. Se adquirió agua deuterada (D2O) de Cambridge Isotope Laboratories, Inc. (Tewksbury, MA). Las ciclodextrinas bromadas con hexakis, heptakis y octakis-C6 se adquirieron de Arachem/Cyclodextrin Shop (Tilberg, Países Bajos). Las reacciones de desplazamiento mediadas por tiol en las ciclodextrinas C6-per-bromadas seguidas de hidrólisis de éster metílico (cuando corresponda) se lograron con una versión modificada del protocolo publicado originalmente por Adam et al36. Para la síntesis de los intermedios de éster metílico del ácido mercaptoalquilcarboxílico, se usó cromatografía de capa fina (TLC) para monitorear su producción usando hojas Merck kieselgel 60-F254 y la detección se logró con luz UV (λ = 254 nm) junto con el desarrollo de color con Ce( SO4)2/(NH4)6Mo7O24·4H2O/H2SO4/H2O (CAM)50,51,52,53 y vapor de yodo54,55,56. La centrifugación se realizó en una centrífuga Eppendorf modelo 5810R a 3220 rpm durante 5 min, utilizando tubos Falcon (50 mL) adquiridos de VWR (Aurora, CO.). Los solventes se eliminaron utilizando un evaporador rotatorio modelo IKA RV8 acoplado a una bomba de filtración al vacío KNF-Lab y un sistema de refrigeración/circulación VWR RS-232 (9 °C agua/etilenglicol 1:1).

Los espectros de RMN 1H (600 MHz), RMN 13C (150 MHz) y RMN 13C-DEPT (150 MHz) se registraron en D2O a menos que se especifique lo contrario. Los espectros se obtuvieron utilizando un instrumento Bruker Avance III de 600 MHz equipado con una criosonda Bruker TCI de 5 mm (Bruker Biospin, Billerica, MA) a 30,0 ± 0,1 °C. Los datos de RMN para los compuestos sintetizados que se detallan a continuación se notifican como sigue: desplazamiento químico (δ) (partes por millón, ppm); multiplicidad: s (singlete), d (doblete), t (triplete), dd (doblete de dobletes), td (triplete de dobletes), m (multiplete), app (aparente) y br (ancho); las constantes de acoplamiento (J) se dan en Hertz (Hz). Para los datos experimentales utilizados en la caracterización de los complejos huésped:huésped, se recopilaron datos de RMN 1H unidimensional con supresión de agua mediante escultura de excitación con gradientes57. Para cada experimento 1-D, se recolectaron de 16 a 128 transitorios (dependiendo de la concentración del analito) utilizando 65 536 puntos de datos, un tiempo de adquisición de 4,0 s y un retraso de relajación de 1,0 s. Antes de la transformación de Fourier, las desintegraciones por inducción libres (FID) se apodizaron con una desintegración exponencial equivalente a un ensanchamiento de línea de 0,25 Hz. Los espectros ROESY bidimensionales se adquirieron utilizando 16 384 puntos de datos con 1024 incrementos, 8—32 escaneos para cada incremento y un bloqueo de giro de onda continua con un tiempo de mezcla de 200 ms y una frecuencia de 3,57 kHz. Se pueden encontrar más detalles en nuestra publicación anterior25. Las masas exactas de los compuestos sintetizados a continuación se obtuvieron en un Bruker micrOTOF-Q III (Bruker Daltonics, Billerica, MA) equipado con una fuente de ionización por electropulverización (ESI). La detección espectroscópica de masas de tiempo de vuelo se realizó en modo de iones negativos. La calibración de masas se realizó en los minutos finales de cada análisis utilizando la mezcla de sintonización de baja concentración ESI-L de Agilent (G1969-85,000). Se utilizó un cromatógrafo de líquidos (LC) Agilent 1260 equipado con una columna de fase inversa Atlantis T3 (C18, 150 mm × 2,1 mm, tamaño de partícula de 3 μm, Waters, Milford, MA) para la separación de todos los compuestos. La fase móvil de LC consistió en agua con ácido fórmico al 0,1 % (A) y acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1 % (B). El perfil de gradiente comenzó con un 95 % de A durante 2 min, aumentó hasta un 5 % de A a los 18 min, se mantuvo durante 13,5 min, volvió rápidamente al 95 % durante 0,5 min y se mantuvo durante 10 min para la regeneración de la columna. Este método se usó para todas las muestras, excepto para el estudio de la superficie de losetas de vinilo, para las cuales el 5 % final de A se mantuvo durante 18,5 min. Se introdujeron diez microlitros de la muestra líquida a través de un muestreador automático (Agilent B1329B) en el puerto de inyección.

Las constantes de unión de equilibrio entre la familia de CD y el fentanilo HCl se determinaron usando experimentos de titulación de 1H NMR. Para derivar la constante de unión más precisa, la concentración de ciclodextrina [H]T (en unidades de M) satisfizo la desigualdad [H]TK < 1 siempre que sea posible. Los estudios iniciales requerían estimaciones aproximadas de K ya que eran desconocidas a priori. En última instancia, esta condición se cumplió para todos los compuestos excepto para SBX + 1, donde la concentración requerida produjo una relación señal/ruido inaceptable. El uso de esta concentración no ideal conduce a una mayor incertidumbre en la constante de unión derivada (vide infra). Debido a las solubilidades acuosas limitadas de los compuestos neutros 5–7 (< 1 mg·mL-1 en todos los casos), todas las titulaciones se realizaron a [H]T < 0,1 mM. Cada una de las CD modificadas se disolvió en agua deuterada (D2O) hasta un volumen total de 500 μL con 1 μL de acetonitrilo agregado como punto de referencia de desplazamiento químico. A continuación, se valoró el HCl de fentanilo en la solución. Se varió la concentración total de fentanilo HCl (unido a ciclodextrina + libre en solución) [G]T (en unidades de M) para cubrir el rango de concentraciones entre \(\frac{\left(0.2{\left[H\right] }_{T}+0.25\right)}{K}\) y \(\frac{\left(0.8{\left[H\right]}_{T}+4\right)}{K}\) para permitir la extracción precisa de las constantes de enlace. En cada punto de titulación, se registraron los desplazamientos químicos de protones (referidos al acetonitrilo a 2,014 ppm) de los protones H1, H3, H5 y H6 en el CD; La resta del desplazamiento químico obtenido del primer punto de datos, que consiste en la ciclodextrina sola, arrojó una diferencia entre el desplazamiento químico enlazado y libre \(\Delta {\delta }_{i}\) para cada uno de los protones indicadores i. Las curvas resultantes de \(\Delta {\delta }_{i}\) frente a [G]T se ajustaron inicialmente (Mathematica 10, Wolfram) usando un algoritmo de mínimos cuadrados no lineales discutido previamente (ver detalles matemáticos adicionales en Compatibilidad). información)31. Como en nuestro trabajo anterior, la constante de enlace K y un factor de sensibilidad de cambio químico \(\Delta {\updelta }_{c,i}\) para cada protón informador son los parámetros de ajuste. La restricción de K a un solo valor para cada curva de titulación de RMN produce una constante de unión global que incorpora datos de todos los protones indicadores58. Todos los experimentos se realizaron por triplicado. Los valores informados de K para cada compuesto son el promedio y la desviación estándar de los tres experimentos.

La dinámica molecular (MD) se realizó con AMBER59 (versión 12) empleando las cargas y los parámetros recientes aplicados para andamios de ciclodextrina60,61 y el campo de fuerza GAFF para los diversos fentanilos62 en sus estados protonados63. Las cargas de fentanilo se generaron mediante cálculos AM1-BCC55 en el programa ANTECÁMARA. Se empleó el programa CHIMERA para modelar los procesos de complejación CD:fentanilo64. Los complejos de CD y CD:fentanilo se solvataron en una caja de agua TIP3P de tamaño suficiente para tener al menos 15 Å de agua entre el soluto y la interfase del solvente (~ 51 × 51 × 51 Å3 del tamaño inicial de la caja)65. Para neutralizar los sistemas, se agregaron suficientes iones de sodio (Na+) (normalmente uno) al sistema. Los sistemas constaban de unos 12.500 átomos (~ 4.100 moléculas de agua). Se minimizó la energía de cada sistema usando 250 pasos de descenso más pronunciado y 1500 pasos de gradiente conjugado. Se realizaron dinámicas de temperatura y presión constantes (NPT) en estos sistemas minimizados66,67. Se utilizaron condiciones de contorno periódicas y las interacciones electrostáticas se trataron mediante métodos Ewald de malla de partículas utilizando un corte de 9 Å en el espacio directo con una cuadrícula de 1 Å68. Los enlaces que contenían hidrógeno se restringieron usando SHAKE y se usó un paso de tiempo de 2 fs para cada simulación69. Los sistemas se acoplaron inicialmente a un baño de calor a 100 K durante los primeros 100 ps, luego aumentaron a 200 K durante los siguientes 100 ps y finalmente aumentaron a 300 K durante el resto de la simulación. Cada simulación se realizó por un total de 10 ns o 30 ns dependiendo del CD invitado. Las simulaciones iniciales involucraron solo trayectorias individuales, pero se observó universalmente que la estructura βCD no cambió significativamente durante la simulación, y que la desviación cuadrática media de los átomos que no son de hidrógeno en relación con la estructura promedio se estabilizó rápidamente en 1 ns. Los primeros 2,5 ns de la dinámica de 300 K se utilizaron para el equilibrio. Para obtener datos e información estadística más completos, se realizaron diez simulaciones repetidas (10 ns cada una) para complejos entre los cuatro fentanilos cargados y βCD donde la molécula huésped estaba paralela al borde más ancho del CD. Estas simulaciones replicadas se caracterizaron por cambiar el valor inicial para generar las velocidades iniciales del sistema.

La energía libre de unión entre las ciclodextrinas y los fentanilos se estimó utilizando el método de Mecánica Molecular-Área Nacida Generalizada (MM-GBSA) a partir de instantáneas de las trayectorias solvatadas70,71,72,73. Los cálculos de energía de MM-GBSA se realizaron en simulaciones repetidas y luego se promediaron para obtener la energía de enlace promedio para un sistema particular de fentanilo:CD. La energía libre de enlace se estimó mediante la ecuación:

donde cada término, G se estima como la suma de la energía mecánica molecular en fase gaseosa Egas y la energía de solvatación Gsol:

La contribución de la entropía se despreció en estos cálculos de energía libre. La energía libre de solvatación (Gsol) es la suma de las energías de solvatación polares y no polares de las moléculas determinadas resolviendo la ecuación de Born Generalizada (GB). Las energías libres de unión para los complejos se calcularon utilizando el script MMPBSA.py en AMBER12 en instantáneas de cada trayectoria de 7,5 ns. Para el cálculo se utilizó el modelo Onufriev-Bashford-Case-I GB modificado (ib = 2) con una concentración de sal de fentanilo de 0,24 mM74. La tensión superficial utilizada para calcular la contribución no polar a la energía libre de solvatación fue de 0,0072 kcal mol-1 Å-2.

En este trabajo, hemos estudiado los complejos de inclusión entre varios CD modificados químicamente con el opioide sintético fentanilo. El panel evaluado de CD exhibió cadenas laterales de ácido tioalquilcarboxílico aniónico o cadenas laterales de alcoholes tioalquílicos neutros en su borde superior. Se encontró que los CD cargados tenían interiores hidrofóbicos extendidos que se mantenían abiertos por repulsión de cadena lateral electrostática mutua, proporcionando así un bolsillo de unión suficiente para el opioide. Se encontró que las simulaciones MD de los complejos de inclusión SBX:fentanilo eran consistentes con las tendencias de afinidad de unión extraídas de los experimentos de RMN. Es decir, la fuerza de unión aumenta a medida que aumenta la longitud del brazo modificado para los tres CD cargados estudiados. Para los CD con cadenas laterales de tioalquilo neutras, se observó que las afinidades de unión disminuían al aumentar la longitud del brazo, probablemente como resultado de la unión competitiva de las cadenas laterales neutras más hidrófobas que también buscan los interiores de SBN hidrófobos. Las simulaciones MD también respaldaron este fenómeno de unión competitiva que reveló que los brazos más largos tendían a interactuar más fuertemente con el interior hidrofóbico. Para el panel de SBX cargados prometedores, se encontró que la afinidad de unión máxima de fentanilo era Ka = 66 500 M-1 para SBX + 1. Hasta donde sabemos, esta es la mayor afinidad de unión de equilibrio informada para complejos de CD:fentanilo. Creemos que estos andamios de CD podrían convertirse en candidatos a contramedidas médicas novedosas y prometedoras contra estos opioides potencialmente mortales. Otra vía importante para futuras investigaciones, pero que no se cubre actualmente: el poder potencial de ajustar simultáneamente datos de titulación y gráficos de Job para extraer valores más confiables de parámetros de ajuste altamente correlacionados. Nuestro grupo también se está enfocando en la explotación de estos compuestos para la eliminación ambiental de fentanilos, así como para la detección de estos opioides en muestras forenses biológicas complejas.

Todos los datos generados o analizados durante este estudio se incluyen en este artículo publicado y sus archivos de información complementaria.

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Este trabajo fue realizado bajo los auspicios del Departamento de Energía de EE. UU. por el Laboratorio Nacional Lawrence Livermore bajo el Contrato DE-AC52-07NA27344. El trabajo fue financiado en su totalidad por una subvención de investigación y desarrollo dirigida por laboratorio (14-ERD-048) a CAV

Dirección de Ciencias Físicas y de la Vida, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, Livermore, CA, 94550, EE. UU.

Brian P. Mayer, Daniel J. Kennedy, Edmond Y. Lau y Carlos A. Valdez

División de Ciencias Nucleares y Químicas, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, 7000 East Avenue, Livermore, CA, L-090 94550, EE. UU.

Brian P. Mayer, Daniel J. Kennedy, Edmond Y. Lau y Carlos A. Valdez

Centro de Ciencias Forenses, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, Livermore, CA, 94550, EE. UU.

Brian P. Mayer, Daniel J. Kennedy y Carlos A. Valdez

División de Biociencias y Biotecnología, Laboratorio Nacional Lawrence Livermore, Livermore, CA, 94550, EE. UU.

Edmond Y. Lau

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CAV sintetizó y purificó todos los compuestos utilizados en este trabajo. BPM y DJK realizaron todos los experimentos de RMN 1D y 2D. EYL realizó todas las simulaciones de dinámica molecular y los experimentos de acoplamiento. CA V y BPM escribieron el manuscrito. Todos los autores revisaron el manuscrito.

Correspondencia a Carlos A. Valdez.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Mayer, BP, Kennedy, DJ, Lau, EY et al. Evaluación de ciclodextrinas polianiónicas como andamios de unión de alta afinidad para fentanilo. Informe científico 13, 2680 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29662-1

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Recibido: 16 noviembre 2022

Aceptado: 08 febrero 2023

Publicado: 15 febrero 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-29662-1

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